Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Субпопуляции лимфоцитов периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с эндометриозом

Д.В. Куявская, К.В. Григорян, С.Ф. Торубаров, Г.Т. Сухих

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва

Проблемы репродукции, 2-1999, с.62-64

В начало...


Изучение субпопуляционного состава мононуклеарных клеток периферической крови и перитонеальной жидкости при разных стадиях эндометриоза (метод проточной цитофлуориметрии) выявило значительные изменения в составе лимфоцитов, более выраженные в перитонеальной жидкости пациенток. Описанные нарушения в иммунитете могут играть немаловажную роль в возникновении и развитии заболевания.

Ключевые слова:

эндометриоз, лимфоциты, перитонеальная жидкость, цитофлюориметрия.

Словарь сокращений

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФЭ - фикоэритрин
ГКГС - главный комплекс гистосовместимости
ЕК-клетки - естественные киллерные клетки
ТКР - рецептор Т-клеток

Наружный генитальный эндометриоз является важной проблемой современной гинекологии, так как, несмотря на совершенствование в течение последнего десятилетия методов диагностики и лечения, заболевание остается одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста: заболевание поражает 15-20% женщин в возрасте 20-35 лет [4]. Вопрос об этиологии и патогенезе эндометриоза, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза. У пациенток с эндометриозом выявляются значительные изменения как на системном (увеличение содержания Т-, ЕК-лимфоцитов в периферической крови), так и на локальном (возрастание количества лимфоцитов, нарушение функциональной активности естественных киллерных клеток (ЕК-клеток) в перитонеальной жидкости) уровнях [8, 14]. При этом большинство авторов рассматривают смешанную группу больных эндометриозом, куда входят пациентки со всеми стадиями заболевания. В настоящем исследовании мы изучали содержание лимфоидных клеток и их фенотипы в периферической крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ) женщин с эндометриозом в зависимости от степени распространенности заболевания.

Материал и методы

В настоящее исследование вошло 40 пациенток, проходивших обследование и лечение в Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу наружного генитального эндометриоза, и 17 соматически здоровых женщин с нормальной репродуктивной функцией, поступивших в центр для проведения хирургической стерилизации (группа контроля).

Пациентки с наружным генитальным эндометриозом были разделены на две группы, сформированные на основе диагноза. В 1-ю группу вошли женщины с I-II степенью распространенности эндометриоза (по классификации Американского общества фертильности), во 2-ю группу - с III-IV степенью распространенности.

Материалом для исследования служили клетки ПК и ПЖ пациенток с эндометриозом и женщин контрольной группы.

ПК получали из локтевой вены обследуемых лиц в асептических условиях в пробирки, содержавшие 0,5 мл раствора гепарина в среде 199 (25 ЕД гепарина на 1 мл крови). Выделение мононуклеарных клеток (МНК) проводили центрифугированием на градиенте плотности фиколла (Lymphocyte Separation Medium, Flow Laboratories, США, r=1,077 г/см2).

ПЖ собирали во время проведения оперативной лапароскопии по поводу эндометриоза либо стерилизации по Zemm. ПЖ собирали из дугласова и переднематочного пространства непосредственно после вхождения в полость малого таза, до начала лапароскопических манипуляций для предотвращения попадания в ПЖ крови. Геморрагические образцы перитонеальной жидкости не исследовали. ПЖ собирали в стерильные гепаринизированные пробирки (Falcon, США) при комнатной температуре и максимально быстро доставляли в лабораторию [15]. Мононуклеарные клетки (МНК) ПЖ выделяли аналогично выделению МНК крови.

Выделенные МНК ПК и ПЖ окрашивали для последующего анализа на проточном цитофлуориметре, используя моноклональные антитела: Anti-Leu-4 (CD3), Anti-Leu-3a (CD4), Anti-Leu-2a (CD8), Anti-Leu-11b (CD16), Anti-Leu-12 (CD19), Anti-TCRgd (, США). Для контроля неспецифического связывания моноклональных антител использовали соответствующие контроли изотипов иммуноглобулинов (, США), меченные ФИТЦ и ФЭ.

Фенотипирование лимфоцитов ПК и клеток ПЖ проводили на проточном цитофлюориметре (Bio-Rad, Италия). Из каждой пробы анализировали 5000 жизнеспособных клеток, дискриминируемых по интенсивности свечения пропидиума йодида.

Cтатистическая обработка экспериментальных данных проводилась с помощью компьютерной программы , достоверность межгрупповых различий определялась по t-критерию Стьюдента. Данные представлены в виде среднего ошибка среднего (М m).

Результаты

В ПК женщин с III-IV степенью эндометриоза обнаружено достоверное снижение общего количества Т-лимфоцитов, а также выраженное повышение процентного содержания В- и ЕК-клеток (р<0,01). По этим показателям были зафиксированы также межгрупповые различия. Изменения в клеточном звене иммунитета у женщин с малыми формами эндометриоза выражались в снижении содержания клеток CD8+ фенотипа и увеличении относительного количества $\gamma$$\delta$-Т-клеток (табл. 1).

Таблица 1. Относительное содержание (в % ) основных клеточных популяций в ПК женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы (M m)
Кластер дифференцировки (CD) Контрольная группа (n=17) Больные эндометриозом
I-II степени (n=20) III-IV степени (n=20)
CD3 64,2 1,59 62,0 1,4 56,8 2,2a
CD4 38,7 1,3 37,5 1,7 34,9 1,8
CD8 25,6 1,3 20,7 1,7a 24,5 2,0
CD4/CD8 1,6 0,1 2,1 0,2a 1,7 0,2
$\gamma$$\delta$-Т-клетки 4,1 0,95 7,2 0,73b 6,7 1,6
CD19 7,2 0,8 6,8 1,0 10,5 0,8bc
CD16 16,5 1,4 18,7 1,3 25,7 1,5bc
Примечание. Здесь и в табл. 2: a - статистически значимые различия по t-критерию Стьюдента в сравнении с соответствующим контролем: p<0,05; b - p<0,01; c - статистически значимые различия между группами эндометриоза, p<0,05.

Известно, что величина <индекса иммунорегуляции> (CD4/CD8) является важным показателем гармоничной функции иммунной системы. Как следует из представленных данных, у больных эндометриозом I-II стадии отмечается тенденция к увеличению этого показателя, по-видимому, за счет снижения содержания клеток CD8+.

При сравнении содержания лимфоцитов в ПЖ пациенток с эндометриозом и здоровых женщин не выявлено различий в относительном количестве В-клеток (CD19+) и ЕК-лимфоцитов (CD16+), тогда как во 2-й группе в Т-клеточном звене было обнаружено значительное увеличение как общего количества Т-лимфоцитов, оцениваемого по содержанию клеток CD3+, так и повышение содержания клеток регуляторных субпопуляций - хелперов/индукторов (CD4+) и супрессоров/цитотоксических (CD8+) (табл. 2). Данные различия оказались статистически достоверными при сравнении с результатами анализа не только в контроле, но и в 1-й группе. В 1-й группе исследования не отмечено изменения содержания Т-лимфоцитов, за исключением клеток, экспрессирующих $\gamma$$\delta$-Т-клетки.

Таблица 2. Относительное содержание (в %) основных клеточных популяций в ПЖ женщин с эндометриозом разной степени и контрольной группы
Кластер дифференцировки (CD) Контрольная группа (n=17) Больные эндометриозом
I-II степени (n=20) III-IV степени (n=20)
CD3 49,5 4,1 58,3 2,2 67,4 3,6b
CD4 21,8 1,9 22,1 1,6 29,1 2,1
CD8 32,6 1,7 31,1 2,1 39,8 3,1
CD4/CD8 0,7 0,06 1,1 0,2 0,9 0,12
$\gamma$$\delta$-Т-клетки 7,1 1,2 17,3 3,4 10,6 2,1
CD19 1,2 0,4 0,9 0,4 2,2 0,3
CD16 8,3 2,2 18,1 8,9 8,2 2,1

Обсуждение результатов

Исследованию популяций лимфоцитов ПК при эндометриозе было посвящено много работ, так как известно, что патологические изменения в органах и тканях, содержащих большое количество иммунокомпетентных клеток, могут вызывать значительные изменения в клеточном составе ПК [17], и путем оценки субпопуляционного состава лимфоцитов ПК можно получить информацию о состоянии иммунной системы в целом.

При фенотипировании лимфоцитов ПК пациенток с разной степенью эндометриоза выявлены следующие нарушения иммунитета в группах: при малых формах содержание супрессорно-цитотоксической субпопуляции Т-клеток (CD8+) изменялось в сторону снижения, вследствие чего имеет место увеличение иммунорегуляторного индекса CD4/CD8, кроме того, отмечалось увеличение процента $\gamma$$\delta$-Т-клеток. При III-IV степени эндометриоза были обнаружены другие изменения - повышение содержания В-клеток и ЕК-лимфоцитов. Увеличение содержания ЕК-клеток, ответственных за уничтожение попавших в перитонеальную полость путем ретроградного заброса менструальной крови [9], может быть немаловажным фактором при данном заболевании. Учитывая, что при эндометриозе, с одной стороны, происходит увеличение содержания ЕК-клеток, а, с другой - снижение ЕК-активности [10, 14], можно предположить функциональный дефект этого звена иммунитета. Уменьшение относительного количества клеток фенотипа CD3+, зафиксированное в группе женщин с III-IV степенью эндометриоза, по-видимому, происходит вследствие снижения содержания обеих (CD4+ и CD8+) иммунорегуляторных субпопуляций, поэтому иммунорегуляторный индекс не изменялся. Таким образом, результаты фенотипирования лимфоцитов ПК подтвердили ранее выявленные нарушения клеточного звена иммунитета у больных эндометриозом [2, 5, 15], которые различны по проявлениям у женщин с разной степенью заболевания.

Как и предполагалось, значительно более выраженные изменения в функционировании иммунной системы обнаруживаются на уровне локальном, в непосредственной близости от имплантатов - в ПЖ. Последняя, представляющая микроокружение очагов эндометриоза, содержит как множество растворимых факторов, влияющих на процесс имплантации и роста эндометриоидных эктопий, так и большое количество клеточных элементов, эти факторы продуцирующих [10, 13]. Существует много работ, указывающих на нарушения в клеточном иммунитете при эндометриозе.

Нами показано, что В-клетки представлены в ПЖ как больных эндометриозом, так и здоровых женщин в очень незначительном (1-2%) количестве. Выявленные изменения иммунитета на локальном уровне касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания клеток хелперной субпопуляции (CD4+) и относительного содержания $\gamma$$\delta$-Т-лимфоцитов. Иммунорегуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости [3, 7]. Увеличение при эндометриозе содержания Т-лимфоцитов, в активированном состоянии вырабатывающих спектр цитокинов и факторов роста, в свою очередь способных усиливать рост эндометриоидных клеток in vitro [11], предполагает нарушения в регуляции иммунного ответа. В последние годы выявлены многочисленные биохимические различия эндометриоидной ткани с эутопическим эндометрием, вследствие чего эктопический эндометрий может быть процессирован антиген-презентирующими клетками и представлен Т-лимфоцитам [16]. <Антигенность> собственного эндометрия, имплантировавшегося в перитонеальной полости и вызвавшего заболевание, подтверждает также увеличение содержания на начальных этапах заболевания $\gamma$$\delta$-Т-лимфоцитов, клеток, которые, как известно, независимы от главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) и способны быстро распознавать антиген и реагировать на него [12]. В то же время повышенное количество $\gamma$$\delta$-Т-лимфоцитов определяется у больныхаутоиммунными заболеваниями, например, с синдромом Сьогрена [6], что также косвенно подтверждает возможность аутоиммунных нарушений, которые описывают многие исследователи, у больных эндометриозом. По-видимому, вслед за активацией иммунных процессов на начальных стадиях заболевания на более поздних воспалительный процесс, развивающийся в ответ на присутствие эндометриоидной ткани в перитонеальной полости и из-за невозможности удаления очагов эндометриоза, прогрессирует, в результате чего возникают инфильтрация, фиброз и инкапсуляция очагов эндометриоза [1]. Это подтверждается результатами нашего исследования, в ходе которого были выявлены изменения в Т-клеточном звене иммунитета при III-IV степени эндометриоза.

Все вышеуказанные нарушения в иммунной системе, по-видимому, являются важным звеном в патогенезе эндометриоза. Понимание иммунных процессов, происходящих при эндометриозе как на локальном, так и на системном уровнях, несомненно, позволит найти новые методы диагностики и лечения этого заболевания.

Литература

1. Баскаков В.П. Клиника и лечение эндометриоза. Л Медицина 1990; 240.

2. Старцева Н.В. Клинико-иммунологические аспекты генитального эндометриоза. Акуш и гинек 1980; 3: 23.

3. Badaway S., Cuenca V., Freliech H. Endometrial antibodies in serum and peritoneal fluid of infertile patients with and without endometriosis. Fertil Steril 1990; 53: 930-932.

4. Barbieri R.L. Etiology and epidemiology of endometriosis. Amer J Obstet Gynecol 1990; 162: 2: 565-567.

5. Dmowski W.P. Immunological aspects of endometriosis. Int J Gynaecol Obstet 1995; 50: Suppl 1: 3-10.

6. Gerli R., Agea E., Muscat C. et al. Functional characterization of bearing the gamma-delta T-cell receptor in patients with primary Sjogren's syndrome. Clin Exp Rheumatol 1993; 11(3): 326.

7. Halme J., Becker S., Haskill S. Altered maturation and function of peritoneal macrophages: possible role in pathogenesis of endometriosis. Am J Reprod Immunol 1987; 156: 783- 788.

8. Haney A., Muscat J., Weinberg J. Peritoneal fluid cell populations in infertility patients. Fertil Steril 1981; 35: 696-699.

9. Hill J.A., Heidi M.P., Schiff I., Anderson D.J. Characterization of leucocyte subpopulations in the peritoneal fluid of women with endometriosis. Fertil Steril 1988; 50(2): 216-223.

10. Ho H.-H., Chao K.-H., Chen H.-F. et al. Peritoneal natural killer cytotoxicity and CD25+CD3+ lymphocyte subpopulation are decreased in women with stage III-IV endometriosis. Hum Reprod 1995; 10: 10: 2671-2675.

11. Hornung D., Ryan I.P., Chao V.A. et al. Immunolocalization and regulation of the chemokine RANTES in human endometrial end endometriosis tissues and cells. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82(5): 1621-1628.

12. Kaufmann S.H. gd and other inconventional T lymphocytes: What do they see and what do they do? Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93: 2272-2279.

13. Kubicka U., Olszewski W.L., Tarnowski W., Bielecki K., Ziolkowska A., Wierbicki Z. Normal Human Immune Peritoneal Cells: Subpopulations and Functional Characteristics. Scand J Imminol 1996; 44: 157-163.

14. Oosterlynk D.J., Meuleman C. et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril 1992; 58: 2: 290.

15. Oosterlynk D.J., Meuleman C., Lacquet F.A. Flow Cytometry analysis of lymphocyte subpopulation in peritoneal fluid of women with endometriosis. Am J Reprod Immunol 1994; 31(1): 25-31.

16. Ota H., Igarashi S. Expression of major histocompatibility complex class II antigen in endometriotic tissue in patients with endometriosis and adenomiosis. Fertil Steril 1993; 60(5): 834-838. 17. Westermann J., Pabst R. Lymphocyte subsets in the peripheral blood: diagnostic window on the lymphoid system? Immunology Today 1990; 11: 11: 406-409.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования