Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Зарегистрируйтесь на нашем сервере и Вы сможете писать комментарии к сообщениям Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Патологическая биохимия | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Ингибирование цитокинового синтеза новым стероидом мометазона фуроатом

Б. Бартон, Д. Яаквей, С. Смит, М. Зигель

Научно-исследовательский центр Шеринг-Плау

Вестник дерматологии и венерологии, 3-1999, стр. 43-45.

В начало...


В инициировании и поддержании воспаления участвует ряд цитокинов. Среди них - интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухоли $\alpha$ (TNF-$\alpha$) [1-3]. Все эти три цитокина продуцируются активированными моноцитами, а их количество поддается определению с помощью стандартных лабораторных методик. Известно, что их синтез могут затормоз ить стероиды [1-3].

Учитывая важную роль этих цитокинов в развитии и поддержании воспаления, мы решили использовать наши методики количественного определения цитокинового синтеза с целью ранжировки различных стероидов по степени их ингибирующего влияния на выработку цитокинов.

В процессе исследования получены неожиданные данные: мометазона фуроат (9a,21-дихлоро-11$\beta$,17a-дигидрокси-16a-метил-1,4-прегнадиен-3,20-дион-17-[2']-фуроат (рис.1) оказался наиболее мощным (в сравнении с другими испытанными соединениями) ингибирующим стероидом в отношении синтеза/высвобождения как IL-6, так и TNF-$\alpha$; величинаIC 50 (концентрация, ингибирующая 50% ответной реакции контроля) составила соответственно 0,15 и 0,25 нМ. Ранее было показано, что мометазона фуроат является более сильнодействующим стероидом по сравнению с бетаметазона валератом [4]. Наши данные предоставляют дополнительную информацию относительно возможного механизма высокого потенциала действия мометазона фуроата.

Рис.1. Структура мометазона фуроата.

Важность этих цитокинов в развитии и поддержании воспалительного процесса и способность некоторых стероидов тормозить их синтез достаточно освещены в литературе [1-3]. Поэтому мы решили сравнить диапазон тормозящего действия мометазона фуроата на выработку IL-1, IL-6 и TNF-$\alpha$ с таким же показателем других стероидов.

Соединения компании Шеринг-Плау. Мометазона фуроат, бетаметазона фосфат, бетаметазона валерат, бетаметазона дипропионат и беклометазона дипропионат были получены из Научно-исследовательского центра Шеринг-Плау. Для использования in vitro они были разбавлены в ацетоне или диметилсульфоксиде (ДМСО).

Линия клеток. Клетки WEHI-265.1 мышиной миеломоноцитарной лейкемии помещали в среду RPMI-1640 (GIBCO), содержащую сыворотку теленка-самца (10%; Hyclone, Logan UT), 2-меркаптэтанол (50 мкМ; Sigma, St. Louis МО), 2 мМ L-глутамин (GIBCO), 200 мкМ HEPES-буфера (GIBCO). Клетки выращивались при температуре 37њС при наличии 5% CO2. Количественная оценка ингибирования цитокина (IL-6 и TNF-$\alpha$). Для измерения степени мощности испытываемых стероидов инкубировали стероиды и контрольные среды вместе с клетками WEHI-265.1 (105 клеток в 2 мл среды). Для стимуляции синтеза и высвобождения IL-6 и TNF-$\alpha$ добавляли липосахарид (ЛПС, LPS, Sigma) в концентрации 3 мкг/мл. После 24 ч инкубации удаляли надосадочную жидкость, не содержащую клеток, и проводили количественную оценку с помощью метода ELISA, специфичного для каждого цитокина [5, 6].

Статистический анализ данных ELISA проводился по программе DELTASOFTTM. Для каждого стероида измеряли величину IC 50. Определения проводили в трех повторностях.

Ингибирование IL-1. Для изучения ингибирования синтеза/высвобождения IL-1 использовали макрофаги из брюшной полости мышей линии BALB/c спустя 7 дней после внутрибрюшинного введения Corуnebacterium parvum. Достигали прилипания собранных клеток брюшины к пластиковым чашкам на 90 мин в асептических условиях, после чего прилипшие клетки искусственно стимулировали с помощью ЛПС (2,5 мкг/мл) для индуцирования выработки IL-1. Исследуемые стероиды добавляли в клеточные культуры. Контролем служили культуры, не содержащие стероидов (ДМСО). Через 24 ч свободную от клеток надосадочную жидкость удаляли и диализировали в течение 48 ч в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбеко. Перед количественным анализом супернатант стерилизовали с помощью фильтра. Количественный подсчет биоактивности IL-1 выполняли с помощью тимоцит-костимуляторной пробы. Мыши линии C3H/HeJ, моложе 6 нед, умерщвлялись с удалением у них вилочковой железы (тимуса). Тимусы препарировали до одноклеточных суспензий и помещали в микротитровальные сосуды в количесте 106 клеток на каждый такой сосуд в присутствии фитогемагглютинина (окончательная концентрация 0,6 мкг/мл). Содержащий IL-1 супернатант также помещали в три сосуда, до достижения окончательного объема 250 мкл/сосуд. Полученные образцы смеси инкубировали 48 ч с добавлением за 18 ч до окончания инкубации ударной дозы 3H-тимидина (1 мкКи/сосуд). Клетки собирали на стеклянные волоконные фильтры, радиоактивность каждого образца измеряли методом стандартной жидкостной сцинтилляционной спектрометрии.

Активность IL-1 выражали в ЕД на 1 мл: одна единица эквивалентна обратной величине разведения, дающей 50% максимального количества вещества IL-6 в минуту, полученного в тимоцитарном анализе с положительным контрольным препаратом IL-1, который был приготовлен как описано выше.

В отношении синтеза/высвобождения всех трех цитокинов мометазона фуроат в сравнении с другими стероидами давал наиболее выраженный ингибирующий эффект. Величина IC 50 для IL-6 составила 0,15 нМ (рис.2), для TNF-$\alpha$ -0,25 нМ (рис.3) и для IL-1 0,05 нМ (рис.4). Ранговый порядок исследованных веществ по мере убывания степени ингибирующего действия на выработку цитокинов оказался таким: для IL-6 мометазона фуроат > беклометазона дипропионат > бетаметазона валерат > бетаметазона дипропионат > дексаметазон> гидрокортизон > бетаметазона алкоголь; для TNF-$\alpha$: мометазона фуроат > бетаметазона валерат > бетаметазона дипропионат = дексаметазон > беклометазона дипропионат = бетаметазон фосфат > гидрокортизон; для IL-1: мометазона фуроат > бетаметазона валерат > бетаметазона дипропионат > бетаметазона алкоголь > дексаметазона алкоголь > бетаметазона фосфат. В эксперименте, данные которого представлены на рис. 2,в, не изучалось действие беклометазона дипропионата и гидрокортизона на выработку IL-1.

Рис.2. Ингибирование синтеза IL-6 стероидами. 1 - мометазона фуроат; 2 - бетаметазона дипропионат; 3 - бетаметазона валерат; 4 - бетаметазон; 5 - дексаметазон; 6 - гидрокортизон; 7 - беклометазона дипропионат.

Рис.3. Ингибирование синтеза TNF-$\alpha$ стероидами. 1 - гидрокортизон; 2 - дексаметазон; 3 - бетаметазона фосфат; 4 - бетаметазона валерат; 5 - бетаметазона дипропионат; 6 - беклометазона дипропионат; 7 - мометазона фуроат.

Рис.4. Ингибирование синтеза IL-1 стероидами. 1 - бетаметазона фосфат; 2 - мометазона фуроат; 3 - бетаметазона валерат; 4 - бетаметазона дипропионат; 5 - бетаметазон; 6 - дексаметазон.

При сравнении мометазона фуроата с шестью другими стероидами было обнаружено, что он является наиболее эффективным ингибитором синтеза/высвобождения IL-1, IL-6 и TNF-$\alpha$. Три исследованных цитокина (IL-1, IL-6 и TNA-a) играют очень важную роль в возникновении и поддержании воспалительного состояния [1-3]. Так, они все являются эндогенными пирогенами, по-видимому, благодаря их способности индуцировать синтез простагландина. Как IL-1, так и TNF-$\alpha$ индуцируют нейтрофилию in vivo и вызывают синтез реагентов острой фазы клетками печени [1, 3]. IL-6 является главным медиатором ответной реакции острой фазы у человека и грызунов [7] и важным прогностическим индикатором при септическом шоке [7]. В дополнение к этим видам активности, каждое из этих соединений вовлечено в локальное, а также и в системное воспаление.

Недавно получены данные о роли IL-1 и IL-6 в воспалительных процессах в коже, в особенности при псориазе [8]. Поскольку кератиноциты явно участвуют в образовании обоих этих цитокинов при нормальных условиях, становится понятным увеличение количества IL-1 и IL-6 в пораженной псориазом коже как на м-РНК-, так и на протеиновом уровнях [9, 10]. Возможный механизм, лежащий в основе эффективности местных стероидов при псориазе - ингибирование синтеза IL-1 и/или IL-6. Таким образом, чем сильнее ингибирующее действие стероида на эти цитокины, тем выше эффективность препарата при данном заболевании. Более того, побочных эффектов, вызванных системным применением местных стероидов, можно будет избежать при использовании меньших доз этих сильнодействующих препаратов.

Недавно было показано, что не участвующий в формировании псориаза TNA-$\alpha$ вызывает воспалительное состояние кожи [11]. Показано также, что TNF-$\alpha$ играет роль в других местных воспалительных процессах, таких как острое респираторное заболевание [12]. Таким образом, стероиды, тормозящие синтез TNA-$\alpha$, были бы полезны в лечении не только заболеваний кожи, но и острых респираторных заболеваний.

Соединения, которые могут ингибировать синтез или высвобождение этих цитокинов, будут иметь преимущество перед имеющимися сейчас в распоряжении препаратами, в особенности если потенциал их действия позволит им оставаться эффективными в пониженных дозах.


Вестник дерматологии и венерологии, N 3-1999, стр. 43-45.

Литература

1. Durum S.K., Schmidt J.A., Oppenheim J.J. Interleikin 1: An Immunological perspective. Ann Rev Immunol 1985;3:133.

2. Van Snick J. Interleikin 6: An Overview. Ann Rev Immunol 1990;8:253.

3. Beutler B., Cerami A. The Biology of Cachectin/TNF-$\alpha$ Primary Mediator of the Host Response. Ann Rev Immunol 1989;7:625.

4. Popper T.L., Gentles M.J., Kung T.T. et al. Structure-Activity Relationships of Series of Novel Topical Corticosteroids. J Steroid Chem 1987;27:837.

5. Starnes H.F., Pearce M.K.,Tewari A. et al. Anti-IL6 Antibodies Protect against Lethal Escherichia coli Infection and Lethal Tumor Necrosis Factor-a Challenge in Mice. J Immunol 1990;145:4185.

6. Sheehan K.C.F., Ruddle N.H., Schreiber R.D. Generation and Characterization of Hamster Monoclonal Antibodies that Neutralize Murine Tumor Necrosis Factors. J Immunol 1989;142: 3884.

7. Gauldie J. Interleukin 6 in the Inflammatory Response, In Therapeutic Approaches to Inflammatory Diseases. Eds. A.J. Lewis, N.S. Doherty, N.R. Ackermann. New York:Elsevier Publishing Co Inc 1989.

8. Kupper T.S. Role of Epidermal Cytokines in Immunophysiology. Eds. J.J. Oppenheim, E.M. Shevach. New York: Oxford University Press Inc 1990.

9. Krueger J.G., Krane J.F., Carter D.M., Gottlieb A.B. Role of Growth Factors, Cytokines, and Their Receptors in the Pathogenesis of Psoriasis. J Invest Dermatol 1990;94:135S.

10. Grossman R.M., Krueger J., Yourish D.G.P. et al. Interleukin 6 is Expressed in High Levels in Psoriatic Skin and Stimulates Proliferation of Cultured Human Keratinocytes. Proc Natl Acad Sci (USA) 1989;86:6367.

11. Sharpe R.J., Margolis R.J., Askari M. et al. Induction of Dermal and Subcutaneous Inflammation by Recombinant Cachectin/Tumor Necrosis Factor (TNF-$\alpha$) in the Mouse. J Invest Dermatol1988;91:353.

12. Stephens K.E., Iscizaka A., Larrick J.W., Raffin T.A. Tumor Necrosis Factor Causes Increased Pulmonary Penreability and Edema. Am Rev Respir Dis 1988;137:1364.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования