Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Лабораторная и функциональная диагностика | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
Впервые в России разработана отечественная тест-система для выявления видоспецифических антител класса G к Chlamydia trachomatis с использованием рекомбинантного антигена хламидий. Ее эффективность была продемонстрирована в клинических испытаниях в условиях шифрованного опыта. По показателям чувствительности, специфической активности, эксплуатационным качествам тест-система "Хлами-IgG-ДС-Tr" не уступает зарубежным аналогам.

Ключевые слова: Chlamydia trachomatis, диагностика, тест-система для выявления IgG к C.trachomatis. По оценке ВОЗ среди заболеваний, передающихся половым путем, урогенитальный хламидиоз занимает второе место после трихомонадных инфекций. Более 90 млн новых случаев инфицирования Chlamydia trachomatis происходит ежегодно в мире, а экономический ущерб составляет 2,4 млрд долларов [1-3].

Выраженный полиморфизм клинических проявлений значительно осложняет клиническую диагностику хламидиозов. Из-за малочисленности симптомов и как следствие - несвоевременности диагностики заболевание нередко приобретает хроническое течение, приводя к развитию разнообразных осложнений [2]. Значение C.trachomatis в инфекционной патологии человека определяется многоочаговыми поражениями мочеполовой системы (уретритами, эпидидимитами, простатитами, цервицитами, сальпингитами и т.д.), а также экстрагенитальным хламидиозом (фарингиты, коньюнктивиты, пневмонии новорожденных, болезнь Рейтера). У женщин несвоевременная диагностика и лечение инфекций, связанных с C.trachomatis, приводят к серьезным нарушеняим репродуктивной функции и осложнениям (воспалительные заболевания органов малого таза, преждевременные роды, эктопическая беременность, бесплодие). Кроме того, инфицирование C.trachomatis увеличивает риск проникновения ВИЧ-инфекции [4]. Широкий спектр клинической патологии, вызываемый данным возбудителем, подробно описан в отечественной и зарубежной литературе [5, 6].

Решающее значение в выявлении хламидийных инфекций принадлежит методам лабораторной диагностики, которые включают в себя и данные серологии (обнаружение различных классов антихламидийных антител). В то же время необходимо учитывать, что серологические методы имеют второстепенное значение в диагностике острой хламидийной инфекции, так как уровни антихламидийных антител не высоки. Но они успешно используются при тяжелых воспалительных заболеваниях урогенитальной сферы, при постановке диагноза хронических последствий инфекций, вызванных C.trachomatis (осложнений), когда другие методы лабораторной диагностики не эффективны и не позволяют выявить антигены, ДНК C.trachomatis или живые микроорганизмы [2, 7, 8]. Современными направлениями в лабораторной диагностике инфекций, вызванных C.trachomatis, становится комплексный подход: использование комбинаций различных диагностических тестов для скрининга и подтверждения инфицирования C.trachomatis.

Данная работа посвящена описанию первой отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к C.trachomatis, прошедшей государственные испытания в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Материал и методы

В работе использовали: рекомбинантный антиген, полученный путем амплифицирования и клонирования фрагмента гена МОМР, кодирующего С-концевой полипептид в составе плазмиды pGEM-T, с последующими переклонированием вставки в экспрессирующий вектор рЕТ-15b и трансформацией в штамм E.coli BL21 (DE3). Очищенный рекомбинантный антиген использовали в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы при создании экспериментально-производственных серий иммуноферментной тест-системы "Хла-ми-IgG-ДС-Tr", предназначенной для выявления видоспецифических антител класса G к C.trachomatis в сыворотке крови человека методом непрямого иммуноферментного анализа. Данная тест-система разработана ЗАО "Медико-биологический союз" (МБС) совместно с НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор", ООО "Биоагромед" и ЗАО "ИМДИ".

В качестве референс-тест-системы, любезно предоставленной представительством в Москве фирмы "Labsystems" (Финляндия), использовали - " Chlamydia trachomatis IgG EIA Test". Государственные испытания были проведены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в условиях шифрованного опыта. Материалом исследования служили 180 сывороток крови от больных хламидиозом или здоровых лиц, полученных в медицинских учреждениях Москвы и Новосибирска.

Для анализа антихламидийных антител использовали метод иммуноферментного анализа, согласно прилагаемым к наборам инструкциям. При получении рекомбинантного антигена C.trachomatis все манипуляции с ДНК, включая электрофоретический анализ, обработку эндонуклеазами рестрикции, лигирование, трансформацию, экспрессию и наработку антигена в виде телец включения, содержащих рекомбинантный белок, осуществляли согласно руководству [9]. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с рекомендациями И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева [10].

Результаты и обсуждение

Для создания отечественной тест-системы для выявления видоспецифических антител класса G к C.trachomatis был использован рекомбинантный антиген хламидий.

Анализ зарубежной литературы [11, 12] показал, что использование рекомбинантных белков или синтетических пептидов позволяет существенно повысить чувствительность и специфичность разработанных ИФА-тест-систем. Например, широко распространенная в мире коммерческая ИФА-тест-система для выявления видоспецифических антител к C.trachomatis фирмы "Labsystems" (Финляндия) разработана на основе синтетических пептидов. Аналогичные тест-системы разработаны фирмами "Savyon Diagnostics Ltd" (Израиль) и "Medac" (Германия). Важно подчеркнуть, что у данных тест-систем отсутствует перекрест к Chlamydia pneumoniae-антителам, что особенно важно, учитывая, что у 80-90% людей с возрастом наблюдаются различные уровни антител к C.pneumoniae.

Согласно данным ряда исследователей, основной белок наружной мембраны (МОМР - Major Outer Membrane Protein или ОМР-1) обладает выраженными иммуногенными свойствами. Он экспонирован на поверхности хламидийных клеток, составляя около 60% суммарного поверхностного белка и является основным серотипирующим иммуногенным антигеном C.trachomatis. Известна полная нуклеотидная последовательность данного белка, хорошо изучена его доменная структура [3, 4]. Это позволило нам оптимально подобрать праймеры к фрагменту белка, содержащего видоспецифические эпитопы, клонировать соответствующий участок гена. Использование плазмиды семейства рЕТ позволило получить рекомбинантный продукт, содержащий на С-конце гистидиновый 6-членный пептид. Наличие поли-His обеспечило аффинитет рекомбинантного белка к Ni-нитрилацетат-сефарозе (Ni-NTA-агароза), что сделало возможным последующую аффинную очистку рекомбинантного белка. Результаты электрофореза аффинно-очищенного рекомбинантного белка представлены на рисунке. Денситометрия белковых полос элюата показала, что чистота антигенного препарата составляет не менее 95%. Полученный рекомбинантный белок МОМР C.trachomatis не обладал перекрестными реакциями к антителам к Chlamydia psittaci и C.pneumoniae.

Рисунок. Электрофорез МОМР в 12,5% полиакриламидном геле с SDS.Дорожки: 1 - Молекулярные стандарты (14,3 кДa, 25 кДa, 30 кДа, 43 кДа, 67 кДа); 2 - тотальная солюбилизированная фракция; 3 - проскок на Ni-NTA-агарозе; 4 - повторная солюбилизация осадка; 5 - промывка сорбента, рН 8,0; 6-8 - промывка сорбента, рН 6,3; 9-20 - элюция МОМР, рН 6,3 - 250 мМ имидазола.
Окраска Кумасси R-250.

Таким образом, был впервые получен высокоочищенный видоспецифический рекомбинантный антиген, который был использован в качестве сенсибилизирующего компонента для планшетов новой отечественной тест-системы "Хла-ми-IgG-ДС-Tr".

Предварительное изучение экспериментально-производственных серий данной системы показало перспективность применения рекомбинантного антигена для повышения чувствительности и специфической активности препарата. Данные изучения стабильности тест-системы показали, что испытуемая тест-система стабильна при хранении и устойчива к перепадам температур. Так, при хранении тест-систем "Хлами-IgG-ДС-Tr" при 2-10 њС в течение 4 месяцев уровень сигналов снижается на 5-10% от исходных значений. Термодеградационный тест показал, что при выдерживании данной тест-системы при 37 њС в течение 11 дней уровень сигналов снижается в среднем на 15%, а при хранении тест-системы с перепадами температур (18 часов при -12 њС, 6 часов - при 37 њС) в течение трех суток уровень сигналов снижается в среднем на 30%. При этом чувствительность и специфичность во всех сериях после хранения при различных режимах не меняется, что характеризует высокую стабильность тест-системы при хранении и транспортировке к потребителю.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования