Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
Исследованы устойчивые к актиномицину D (АМД) и грамицидину S (Г) штаммы Staphylococcus aureus, полученные путем пассирования на средах с этими антибиотиками штамма S.aureus 209Р. Штамм R80, устойчивый к АМД, а также описанный ранее штамм R9, устойчивый к Г и обнаруживший одновременное возрастание устойчивости к АМД, не вызывали ферментативной деградации АМД. У клеток обоих штаммов заметно снижена способность поглощать АМД из среды. Электронно-микроскопические исследования показали, что клетки штамма R80 не только обладают утолщенной клеточной стенкой (что было показано ранее для штамма R9), но и обнаруживают более высокую электронную плотность клеточных стенок, чем клетки штамма R9 и исходного чувствительного штамма. Адаптация к АМД или Г изменяет также эффективность функционирования некоторых поверхностных белков стафилококка - активность связанной с клетками коагулазы (фактора слипания) обнаруживается только у клеток штамма R9. Внеклеточная коагулаза присутствует у всех штаммов, однако приобретение устойчивости к АМД или Г снижает в разной степени активность фермента. Предполагается, что развитие устойчивости к АМД или Г приводит к существенным изменениям в клеточных стенках стафилококков, при этом характер изменений в обоих случаях различен.

Ключевые слова:

Staphylococcus aureus, актиномицин D, грамицидин S, механизмы устойчивости к антибиотикам, электронная микроскопия.

Проведенное нами ранее [1, 2] исследование штамма Staphylococcus aureus, адаптированного к грамицидину S и обнаружившего одновременное повышение устойчивости к актиномицинам, показало, что клеточные стенки устойчивых клеток были в 1,5-2 раза толще стенок клеток исходного чувствительного штамма стафилококка. Кроме того, у устойчивых клеток способность поглощать из среды актиномицин D (АМД) была значительно снижена по сравнению с чувствительными клетками. При этом возникшие в клетках под влиянием достаточно длительного воздействия на культуру стафилококка грамицидина S изменения не повлияли на уровень чувствительности клеток к беталактамам, аминогликозидам и ряду других антибиотиков, однако обеспечили снижение более чем на порядок, чувствительности к актиномицинам - антибиотикам с совершенно иным механизмом действия, чем грамицидин S.

Целью данной работы было изучение изменений, происходящих в клетках стафилококка при адаптации их непосредственно к АМД, и сравнение этих изменений с обнаруживаемыми у клеток, адаптированных к грамицидину S и проявляющих устойчивость к АМД. Был получен штамм стафилококка, устойчивый к АМД, и проведено сравнительное изучение двух устойчивых штаммов.

Материал и методы

В работе использовали три штамма золотистого стафилококка: штамм Staphylococcus aureus 209P, чувствительный к грамицидину S и АМД (МПК грамицидина S 2,0-2,5 мкг/ мл, актиномицина D - 0,8 мкг/мл), и два устойчивых штамма. Устойчивый к грамицидину S штамм R9 был получен путем последовательных пересевов чувствительного штамма 209P на среде с этим антибиотиком и описан ранее [1]. Штамм R9 обнаружил помимо устойчивости к грамицидину S (МПК 20-25 мкг/мл) повышение устойчивости к АМД (МПК 10-20 мкг/мл). Устойчивый к АМД штамм R80 получен путем последовательных пересевов штамма S.aureus 209P на мясо-пептонном бульоне (МПБ), содержащем возрастающие концентрации АМД; штамм растет в присутствии 80-100 мкг/мл АМД.

Микроорганизмы выращивали на МПБ в колбах на качалках и на мясо-пептонном агаре (МПА) при 37 њС.

Препараты АМД, грамицидина S и гелиомицина получены путем биосинтеза и очищены в лаборатории антибиотиков кафедры микробиологии биологического факультета МГУ, производные грамицидина S получены на химическом факультете МГУ путем химической модификации грамицидина S. В молекулах производных обе свободные аминогруппы остатков орнитина ацилированы остатками глицина (N,N'-глицилграмицидин), аминокапроновой кислоты (N,N'-аминокапронилграмицидин) или превращены в гуанидиновую группировку (N,N'-гуанилграмицидин).

Неотеломицин, канамицин, даунорубицин (рубомицин), доксорубицин и карминомицин были любезно предоставлены сотрудниками НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН. Использованы также препараты цефалоридина ("Glaxo"), хлорамфеникола, тетрациклина, рифампицина (АООТ"Акрихин"), бензилпенициллина, ампициллина, эритромицина, олеандомицина, новобиоцина, ристомицина ("Sigma"), ванкомицина ("Ely Lilly").

Определение возможной ферментативной инактивации АМД клетками устойчивого штамма R80 проводили как описано ранее [2].

Определение чувствительности штаммов к антибиотикам проводили методом разведений в МПБ, внося рассчитанные количества раствора антибиотика в ряд пробирок с МПБ, засеянным исследуемой культурой. Рост культур оценивали по величине оптической плотности культуральной жидкости после инкубации при 37 њС в течение 18 ч. После предварительного ориентировочного определения активности препаратов титрование повторяли в более узком диапазоне концентраций. Зависимость оптической плотности культуральной жидкости от концентрации препарата выражали графически.

Связывание АМД клетками стафилококка определяли по ранее описанной методике [2] спектрофотометрически по разности между количеством антибиотика в среде в начале опыта и после инкубации в ней клеток.

Для определения функциональной активности коагулазы и фактора слипания поверхностного белка S.aureus, вызывающего агглютинацию собственных клеток при взаимодействии их с фибриногеном, исследуемые штаммы выращивали на МПБ в течение 18 ч. Количество биомассы в культуральной жидкости определяли по величине оптической плотности и рассчитывали по стандартной кривой. Инкубационная смесь для определения коагулазной активности содержала: 40% плазмы крови, культуральную жидкость в количестве, соответствующем 0,16 мг сухой массы клеток на I мл, физиологический раствор до объема 0,5 мл. Смеси для обнаружение активности фактора слипания содержали от 0,03 до 0,5% фибриногена, культуральную жидкость в количестве, соответствующем 0,5 мг сухой массы клеток на I мл, физиологический раствор - до I мл. Инкубационные смеси выдерживали при 37 њС, отмечая момент появления сгустка (определение коагулазы) или начала агглютинации клеток (определение фактора слипания). В этих экспериментах использовали плазму крови человека производства ООИ "Ассоциация больных гемофилией" и фибриноген производства Каунасского предприятия по производству бактерийных препаратов (Литва).

Электронно-микроскопическое изучение срезов клеток проводили как описано ранее [2].

Результаты и обсуждение

Устойчивый к АМД штамм S.aureus R80 был получен путем последовательных пересевов штамма S.aureus 209P на МПБ с возрастающими концентрациями этого антибиотика. Штамм способен расти в присутствии 80-100 мкг/мл АМД, МПК АМД в отношении исходного штамма составляла 0,8 мкг/мл.

В связи с имеющимися данными [3, 4] о способности некоторых бактерий инактивировать актиномициновые антибиотики путем ферментативного гидролиза лактонной связи в их молекуле нами была исследована возможность такого гидролиза АМД клетками устойчивого штамма с образованием неактивных продуктов. Исследовали ацетоновые экстракты из клеток R80, выращенных в присутствии суббактериостатических концентраций АМД или инкубировавшихся в растворе АМД, а также этилацетатные экстракты центрифугатов культуральной жидкости и суспензий клеток. Экстракты из клеток и центрифугатов подвергали тонкослойной хроматографии и электрофорезу. Во всех случаях обнаруживался только интактный АМД, но не его монолактон или актиномициновая кислота. При биоавтографии электрофореграмм и хроматограмм зоны подавления роста тест-культуры S.aureus 209P совпадали с зонами локализации АМД. Таким образом, ферментативная деградация антибиотика не является фактором устойчивости к АМД штамма R80, как и штамма R9 [2].

Устойчивый к грамицидину штамм R9 обнаружил возникновение устойчивости к АМД и другим антибиотикам актиномициновой группы. Для выявления возможной перекрестной устойчивости штаммов R9 и R80 к грамицидиновым и актиномициновым антибиотикам была исследована чувствительность штамма R80 к грамицидину S и близким к нему соединениям - циклопептидам. Уровень устойчивости штамма R80 к большинству исследованных циклических полипептидов был повышен примерно в 2 раза (табл. 1). Штамм R9 к исследованным полипептидам был устойчив - значения МПК составляли более 25-50 мкг/мл.

Таблица 1. Чувствительность стафилококков к актиномицину D, грамицидину S, производным грамицидина и тироцидину
Антибиотики Kонцентрации антибиотиков, подавляющие рост культур на МПБ (в мкг/мл)
исходный штамм S.аurеus 209P штамм R80, устойчивый к актиномицину D штамм R9, устойчивый к грамицидину S
Актиномицин D 0,8 80-100 10-20
Грамицидин S 2,0 5,5 20-25
Гуанилграмицидин 4,5 9,0 50
Глицилграмицидин 6,2 10,0 50
Аминокапронилграмицидин 8,0 30,0 50
Тироцидин 5,5 17,0 30-40

Штамм R80 так же, как и грамицидиноустойчивый штамм R9, сохраняет чувствительность к широкому кругу антибиотиков: беталактамам, аминогликозидам, тетрациклину, гелиомицину, рифампицину, эритромицину, олеандомицину, неотеломицину, новобиоцину, даунорубицину, карминомицину и доксорубицину. В то же время у обоих штаммов отмечено некоторое снижение чувствительности к ванкомицину, антибиотику, действующему на пептидогликансинтезирующую систему бактерий [5, 6]. На рис. 1 отражено влияние антибиотиков на рост культур исследованных штаммов: рис. 1,а - снижение чувствительности к АМД у штамма R9; рис. 1,б - снижение чувствительности к грамицидину S у штамма R80; рис. 1,в - снижение чувствительности к ванкомицину у обоих штаммов; рис. 1,г - сохранение чувствительности к эритромицину.

Рис. 1. Рост культур штаммов стафилококка в присутствии различных антибиотиков.
По оси абсцисс - концентрация препарата, мкг/мл; по оси ординат - оптическая плотность культур S.aureus.
a - актиномицин D, б - грамицидин S, в - ванкомицин, г - эритромицин. 1 - чувствительный исходный штамм 209Р, 2 - устойчивый к актиномицину штамм R80, 3 - устойчивый к грамицидину S штамм R9.

Таким образом, оба полученные нами штамма стафилококка проявляют перекрестную устойчивость к АМД и грамицидину S, различающуюся по уровню, а также в равной степени обнаруживают снижение чувствительности к ванкомицину, сохраняя чувствительность к ряду других антибиотиков.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования