Дифракционный предел, открытый в 1873 году Эрнстом
Аббе - это минимально возможный размер светового пятна, которое можно получить,
фокусируя
электромагнитное излучение (свет) заданной длины волны
в среде
с показателем
преломления n:
.
Больше
столетия этот предел пространственного разрешения являлся непреодолимым
препятствием на пути совершенствования техники оптической микроскопии
в дальней зоне.
Для изучения более мелких объектов требовались новые подходы. В XX веке возникли
и активно развивались технологий, использующие квантовые свойства материи, -
электронная микроскопия, сканирующая зондовая
микроскопия и др. Однако фундаментальное
ограничение на пространственное разрешение оптических методик исследования
долгое время оставалось большой проблемой во многих областях естествознания. Конечно,
наиболее очевиден путь уменьшения длины волны используемого излучения, который реализован
в рентгеновской микроскопии, и в этой области разрешение достигает 30 нм, но уходить
далеко в коротковолновую часть спектра
ради увеличения разрешающей способности не всегда допустимо. Например, при исследовании биологических объектов,
например клеточных мембран, нельзя использовать, скажем,
синхротронное излучение. Хоть и возможно получить такое
излучение с длиной волны 2-4 нм,
но оно попросту убьет исследуемую клетку.
4 апреля ученые из Института биофизической химии им. Макса Планка (Max-Planck-Institute
for Biophysical Chemistry) Штефан Хелль и Маркус
Дюба (Stefan Hell, Marcus Dyba) опубликовали статью
в Physical Review Letters, в которой сообщают о своем сенсационном достижении:
благодаря эффективному совместному использованию двух самостоятельных методов повышения
разрешающей способности им удалось наблюдать флуоресценцию
участка клеточной мембраны бактерии Bacillus megaterium
протяженностью порядка
33-46
нм при длине волны излучения в пределах 745-760 нм. Таким образом,
поперечный (поперек пучка) размер оптически разрешаемого объекта соответствует
,
что существенно меньше дифракционного предела. В работе использовались методы конфокальной
микроскопии (или 4-пи микроскопии, то есть сложения когерентных
волновых фронтов от двух линз, расположенных по разные стороны от исследуемого
объекта
на оптической оси системы. Общий фокус линз при этом совпадает
с положением образца) и истощения вынужденного
излучения (stimulated emission depletion, STED).
Исследуемый флуоресцирующий объект помещается в общем фокусе
двух соосных линз, однако (в отличие от классической схемы
4-пи
микроскопии) и возбуждение, и наблюдение производятся с помощью одной и той же линзы.
Сразу же после оптического возбуждения коротким (250 фс,
=554
нм) лазерным импульсом на образец падает встречный
13-пикосекундный STED-импульс (
=745-760 нм), стимулирующий излучательные переходы молекул из возбужденного
состояния на один из колебательных подуровней мультиплета основного состояния
в той области объекта, которая частично перекрывается с областью возбуждения. Когда
молекулы,
все еще находящиеся в возбужденном состоянии, уже готовы совершить излучательный
переход,
вслед за первым возбуждающим импульсом приходят еще два. Они отражаются
от образца назад (т.е. в направлении распространения STED-импульса) и формируют стоячую волну. Эта волна действует подобно фильтру,
позволяющему
релаксировать только небольшой части общего числа молекул флуоресцирующего вещества.
В остальном объеме образца флуоресценция сильно подавлена. Именно благодаря
этому
достигается разрешение порядка 1/23 длины волны.
По материалам PhysicsWeb
и препринта Physical Review
Letters 88 163901
от 4 апреля 2002,
а также страницы,
посвященной научной группе Оптической микроскопии высокого разрешения Стефана Хелля.