Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посмотрите новые поступления ... Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Обзорные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
(Продолжение)

Оценивая значение для клиники двух генетически различных механизмов резистентности к макролидам - изменение первичной структуры 23 S рибосомной РНК или ее модификация за счет метилирования, следует, как нам кажется, изучить в сравнительных исследованиях скорость возвращения культуры к чувствительному фенотипу в отсутствие селективного давления антибиотика. Возможен ли здесь однозначный ответ сказать сложно, поскольку не исключено влияние видовых особенностей микроорганизма, конститутивного или индуцибельного характера резистентности и т.п.

Следует отметить, что индуцибельная MLS-резистентность используется для выявления некоторых общих закономерностей индукции как биологического явления - механизма контроля на уровне трансляции и т.д. [18-20].

Несколько позже работ, посвященных изучению механизмов MLS-резистентности, появились сообщения о возможности энзиматической инактивации макролидов резистентными штаммами микроорганизмов. Инактивация макролидов может происходить тремя путями: фосфорилированием, гликозилированием их сахаров или путем расщепления лактонного кольца. С самого начала работ в этой области внимание исследователей было привлечено не только к эубактериям, но и к актиномицетам. Уже в 1971 г. появилось сообщение о фосфорилировании, правда не макролида, а клиндамицина бесклеточным препаратом из Streptomyces coelicolor [21]. В конце 80-х годов было показано, что бесклеточный препарат из S.coelicolor в присутствии АТФ и ионов магния осуществляет конверсию ряда макролидов (олеандомицин, тилозин, лейкомицин А3, смесь спирамицинов) в неактивные в антибиотическом отношении 2'-О-фосфаты [22, 23]. Соответственно было высказано предположение, что О-фосфорилирующий фермент, находясь в продуценте, может защищать его от собственного антибиотика, а в бактериальных клетках такой фермент может резко повышать резистентность к макролидам не только у грамположительных, но и у грамотрицательных бактерий. Было продемонстрировано, что при добавлении олеандомицина или смеси спирамицинов в концентрации 30-100 мкг/мл к 24-часовой культуре S.coelicolor и проведении ферментации в течение трех суток образуются фосфорилированные производные антибиотиков. Выделенные и очищенные их препараты проявляли ингибиторное действие на S.coelicolor лишь в концентрации выше 500 мкг/мл. Параллельно было показано резкое уменьшение зон подавления роста 15 грамположительных и грамотрицательных эубактерий фосфорилированными соединениями по сравнению с нефосфорилированными (бумажные диски насыщались водными растворами сравниваемых соединений в концентрации 1 мкг/мл).

Иной по механизму действия, а именно гликозилирующий и этим инактивирующий ряд макролидов фермент был обнаружен в бесклеточных экстрактах Streptomyces antibioticus АТТС 11891 - продуцента олеандомицина [24]. Субстратами фермента являлись олеандомицин, метимицин, ланкамицин, розарамицин - структуры с разной величиной лактонного кольца, но все имеющие 2'-ОН группу (в моносахаридном остатке). Замещение ее остатком глюкозы было доказано прямым и косвенным путями. Исключением здесь, однако, оказался негликозилировавшийся эритромицин. Не подвергались гликозилированию также макролиды с дисахаридным фрагментом: тилозин, спирамицин, карбомицин, джозамицин, ниддамицин. В случае замещения 2'-ОН группы (как, например, у триацетилолеандомицина), гликозилирования, естественно, не происходило. Кофактором при гликозилировании являлась УДФ-глюкоза, с меньшей скоростью гликозилирование протекало при ТДФ-глюкозе и АДФ-глюкозе. Единственным возможным объяснением недоступности 2'-ОН группы у эритромицина может быть наличие "экстра"гидроксильной группы при С-6 лактонного кольца антибиотика, что может влиять на общую структурную конформацию его молекулы. Авторы пытались обнаружить ферменты, гликозилирующие макролиды, у продуцентов других антибиотиков этой группы. В качестве предполагаемых субстратов испытывались олеандомицин и аутогенный антибиотик. Однако, ни в одном случае гликозилирования не было обнаружено. Так, спирамицин не гликозилировался своим продуцентом S.ambofaciens, тилозин - S.fradiae, карбомицин - S.halstedii, метимицин - S.venezuelae, эритромицин - Saccharopolyspora erythreae.

В плане оценки защитной роли гликозилирующего фермента для своего продуцента авторы обращают внимание на два момента. Прежде всего у продуцента эритромицина, у которого гликозилирующего фермента не было обнаружено, резистентность к собственному антибиотику выявлялась на рибосомном уровне - за счет диметилирования 23 S рибосомной РНК [25].

У продуцента олеандомицина при наличии гликозилирующего собственный антибиотик фермента рибосомы были чувствительны к олеандомицину [26]. Кроме того, в супернатанте культуры продуцента олеандомицина был обнаружен дегликозилирующий олеандомицин фермент. Этот фактически внеклеточный или локализованный на периферии клетки фермент восстанавливал активность олеандомицина во время его освобождения из клетки. Таким образом, предполагается, что временная инактивация защищает рибосомы продуцента от собственного антибиотика.

Возможно, что роль гликозилирующего фермента не ограничивается защитной функцией, а фермент участвует и в сборке самой молекулы антибиотика, т.е. его субстратами могут служить и предшественники этой молекулы. Следует отметить, что данная проблема привлекла внимание применительно не только к макролидам, но и аминогликозидам (аминогликозидфосфотрансферазы и дефосфорилирующие аминогликозиды фосфатазы) [27, 28].

Данные о ферментивном гликозилировании макролидов представителями Streptomyces приводятся и в других работах; при этом отмечается, что впервые об этом на примере эритромицина А и Streptomyces vendargenis было сообщено в 1989 г. [29, 30]. Продуктом ферментативной реакции оказался биологически неактивный 2'-О-гликозилэритромицин. Позднее был подробно изучен фермент, обнаруженный у Streptomyces lividans ТК 21 [31, 32]. Бесклеточный препарат фермента мог использовать в качестве ко-фактора как УДФ-глюкозу, так и УДФ-галактозу; наличие специфической эпимеразы в препарате, правда, не исключается, тем не менее фермент до получения более точных данных назван гликозил(но не глюкозил)трансферазой. Образование фермента индуцировалось линкозамидным антибиотиком целестицином, а также макролидами - эритромицином, олеандомицином, халкомицином.

Субстратами макролидгликозилтрансферазы из S.lividans являлись представители 12-, 14-, 15- и 16-членных макролидных структур - соответственно метимицин, эритромицин, азитромицин и тилозин. Гликозилированию подвергался 2'-гидроксил сахарного остатка, связанного с С-5 в случае 16-членного макроциклического кольца или с С-3 в 14- и 12-членном кольце. Лучшими субстратами для гликозилирования были структуры с одним моносахаридным остатком при С-5 (или С-3), но не с дисахаридным заместителем.

Структурно-функциональные исследования в настоящее время проводятся в широком диапазоне, учитывая разнообразие макролидных структур, т.е. определяется влияние фрагментов и отдельных функциональных групп в структурах на скорость ферментативной реакции. Количество данных быстро возрастает, но описанные до настоящего времени трансферазы катализируют замещение именно 2'-гидроксильной группы. В то же время субстратная специфичность воздействующих на эту группу фосфотрансфераз и гликозилтрансфераз разного происхождения - из E.coli, из Streptomyces разных видов - в количественном отношении варьирует, что в целом типично для изоферментов. Физиологическая роль макролид-гликозилтрансферазы (mgt) для S.lividans пока не находит объяснения, поскольку этот организм не продуцирует макролидных структур; тем не менее mgt проба "гибридизуется" со специфическими последовательностями в геноме продуцентов макролидов. У последних продукт mgt или его гомологов может быть включен в систему экспорта макролида и (или) играть роль в защите макроорганизма от аутогенного антибиотика.

Следует отметить, что резистентность S.lividans к линкомицину и макролидам может определяться двумя генами: erm (кодирует образование монометилтрансферазы, воздействующей на А-2058) и mgt. Гены формируют тандем - котранскрибируются [33]. Первый кодирует образование фермента с мол. массой около 26 кД, близкого к ферменту у продуцентов карбомицина, тилозина и целестицина; второй - макролид-гликозилтрансферазу с мол. массой около 42 кД.

Интерес к системам гликозилирования макролидов у актиномицетов сохраняется и в самое последнее время. Недавно опубликовано обширное исследование, объектами которого служили продуценты макролидов и полиэфирных антибиотиков, т.е. структур, сборка которых также происходит путем поликетидного синтеза [34].

В качестве предполагаемых субстратов, помимо природных антибиотиков, испытывались и новые полусинтетические производные, внедренные в клинику, что может быть важно в отношении прогнозирования их эффективности при широко распространенной в настоящее время эритромицинорезистентности. Особенно подробному сравнительному изучению была подвергнута макролид-гликозилтрансфераза из Streptomyces hygroscopicus ATCC 31080 - продуцента полиэфирного антибиотика карриомицина, сравнивавшаяся с ранее описанным ферментом из Streptomyces antibioticus ATCC 11891 - продуцента олеандомицина. Вновь было показано, что ко-фактором гликозилирующих ферментов является УДФ-глюкоза или УДФ-галактоза. Для протекания реакции были также необходимы ионы магния или марганца. Гликозилировалась 2'-ОН группа дезозаминового фрагмента. Биологическая активность антибиотиков терялась полностью. По субстратному спектру два фермента во многом были сходны, но фермент из продуцента карриомицина гликозилировал тилозин, который субстратом фермента из продуцента олеандомицина, как уже отмечалось выше, практически не являлся. Получены также косвенные указания на локализацию изучавшихся ферментов в мембране стрептомицетов (ее нижних слоях). В этой же работе определялась активность гликозилирующих ферментов на разных стадиях развития культуры продуцента. Установлен параллелизм между проявлением их активности и накоплением вторичных метаболитов (карриомицина и олеандомицина): антибиотики и фермент обнаруживались в стационарной фазе - в период между 48-96 часами ферментации. Функции ферментов, таким образом, связаны со вторичным метаболизмом.

Следует далее отметить, что МПК эритромицина А и В и азитромицина в отношении S.hygroscopicus и S.antibioticus была низка - в пределах 1,56-3,13 мкг/мл (продукты же их гликозилирования не влияли на рост в концентрации 100 мкг/мл). Это свидетельствует, что в ранней ростовой фазе у этих организмов макролид-гликозилтрансферазная активность отсутствует. Иными словами гены биосинтеза антибиотиков и ген, кодирующий гликозилирующий фермент, экспрессируются одновременно.

Испытание на присутствие гликозилирующего макролиды фермента 32 штаммов актиномицетов показало, что у 15 штаммов Streptomyces такая активность обнаруживается. Ее наличие может быть связано с образованием не только макролидов, но вообще продуктов поликетидного синтеза. Авторами предполагается, что ген макролид-гликозилтрансферазы вместе с генами вторичного метаболизма может циркулировать по Streptomyces; кластеры чужеродных генов оказываются факторами эволюции вторичного метаболизма. Архетипом или прототипом гена должен быть, однако, ген одного из продуцентов макролидных антибиотиков. По-видимому, таким продуцентом является продуцент олеандомицина, у которого нет резистентности к собственному антибиотику на уровне рибосом. Нельзя не отметить, что из двух новых макролидов - азитромицина и кларитромицина - только первый являлся субстратом двух испытанных гликозилирующих ферментов.

Накопление данных о ферментах трансформации макролидов у актиномицетов поставило задачу установления их биологической роли - как у продуцентов макролидов, так и видов и штаммов актиномицетов, продуцентами макролидов не являющихся. Как свидетельствует рассмотренный предыдущий материал, определенного рода предположения здесь делались. В частности, поднимается вопрос и о двойной роли таких ферментов, если это позволяет их субстратная специфичность. В кластере генов биосинтеза антибиотика у их продуцентов могут быть и гены, кодирующие фосфорилирующие ферменты; в особенности, или, может быть, преимущественно это касается углеводных фрагментов, имеющихся в структуре ряда антибиотиков. Эти же ферменты могут быть и защитными в случае суперпродуцентов. Однако, не ясен вопрос о субстратной специфичности - возможно она неодинакова у ферментов биосинтеза, фосфорилирующих только фрагмент антибиотика при сборке полной антибиотической структуры, и у ферментов защитных, фосфорилирующих целую молекулу антибиотика.

Изменение субстратной специфичности фермента в результате спонтанных мутаций, появление рядов изоферментов хорошо прослежено, например, в случае бета-лактамаз. Фосфотрансферазы априорно не должны быть исключением. Фосфорилирующие определенные классы антибиотиков ферменты широко распространены среди Streptomyces и других родов почвенных многоклеточных бактерий. Согласно концепции молчащих генов во многих штаммах актиномицетов содержатся кластеры генов биосинтеза "криптических" антибиотиков. Их интенсивный биосинтез начинается лишь после определенных воздействий на клетку, примером здесь в последние годы часто служит протопластирование. Со всем этим следует сопоставить факты обнаружения ферментов, фосфорилирующих макролидные антибиотики в коллекционных штаммах актиномицетов, не относящихся к продуцентам этих антибиотиков. Так, у бесклеточного (после лизиса лизоцимом) препарата из штамма S.coelicolor NRRL 3532 была обнаружена способность фосфорилировать эритромицин (А), олеандомицин, тилозин, комплекс спирамицинов I, II, III и лейкомицин А3 [22]. Во всех случаях фосфорилировалась гидроксильная группа аминосахара, а именно 2'-гидроксил. Второй сахарный остаток фосфорилированию не подвергался. Фосфорилирование эритромицина вело к его превращению в ангидроформу, т.е. ангидроэритромицин-2'-фосфат. Эритромицин В фосфорилировался несколько медленнее эритромицина А. В качестве донора фосфатного остатка можно было использовать АТФ, но не ИТФ, ЦТФ, ГТФ. Для реакции были необходимы ионы магния. Следует подчеркнуть, что скорость инактивации отдельных макролидов значительно различалась, наилучшим субстратом являлся эритромицин А.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования