Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Зарегистрируйтесь на нашем сервере и Вы сможете писать комментарии к сообщениям Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Влияние протопластирования на антибиотическую активность и состав актиномицинового комплекса штамма Streptomyces galbus (F) subsp. аchromogenes 695 и его активных вариантов

Йочева Л.Д., Антонова-Николова С.К.

Биологический факультет Софийского университета им. Св. Кл. Охридского, Болгария

В начало...


Процессы получения и регенерации протопластов способствуют возрастанию изменчивости по признаку антибиотикообразования у штамма Streptomyces galbus (F) subsp. achromogenes 695 и его активных вариантов 695-3-2 и 695-3-2-206. Среди ревертантов штамма 695 отобран вариант 695-Р24, превышающий по активности исходный штамм в 2 раза. Среди всех анализируемых ревертантов не обнаружено вариантов, утративших способность к биосинтезу основных компонентов антибиотика А-695, но протопластирование штаммов 695-3-2-206 и 695-Р24 приводит к появлению вариантов, синтезирующих новые компоненты актиномицинового комплекса.

Ключевые слова:

Streptomyces galbus (F) subsp. achromogenes, протопластирование, актиномициновый комплекс, антибиотическая активность.

Известно, что получение и регенерация протопластов стрептомицетов являются эффективными методами воздействия на геном стрептомицетов - продуцентов антибиотиков и получения штаммов, обладающих более высоким уровнем антибиотикообразования [1-6].

Цель настоящей работы - изучение влияния протопластирования на антибиотическую активность и образование вариантов штаммов Streptomyces galbus (F) subsp. achromogenes 695, 695-3-2 и 695-3-2-206 с измененным составом антибиотического комплекса.

Материал и методы

В работе использовали штамм S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 [7], продуцент противоопухолевого антибиотика А-695, и его высокоактивные варианты: штамм 695-2-3, полученный после воздействия УФ-лучами, и штамм 695-2-3-206, полученный после последующего воздействия нитрозогуанидином.

А-695 - актиномициновый комплекс, содержащий 3 биологически активных компонента, которые условно обозначены как АМ1, АМ2 и АМ3. Главным компонентом антибиотика является АМ2 (58,6%), идентифицированный как актиномицин D. Количество остальных компонентов АМ1 и АМ3 составляет соответственно 31,2% и 10,2%. Актиномициновые комплексы, синтезированные штаммом 695-3-2-206 и штаммом 695-3-2, содержат те же самые компоненты, но в других соотношениях [8].

Обработку мицелия и регенерацию протопластов проводили по методике Оkanishi et al. [9] с небольшими модификациями. Для регенерации протопластов использовали среду R2YЕ [10].

Штаммы и их ревертанты выращивали на среде, содержащей (в г/л): декстрин - 20; КNO3 - 3,5; К2НРO4 - 0,52; МgSO4ћ7Н2O - 0,025; FеSO4ћ7Н2O - 0,025; ZnSO4ћ7Н2O - 0,025; СаСl2ћ2Н2O - 0,025. Ферментацию вели на качалке (220 об/мин) при 28 њС в течение 7 сут. Антибиотическую активность определяли биологическим методом диффузии в агар с тест-культурой УФ2 (мутант Staphylococcus aureus 209).

Концентрацию антибиотика в бутанольных экстрактах культуральной жидкости штаммов и их ревертантов определяли спектрофотометрически, а его состав - методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах "Merck Kieselgel 60" в системе растворителей этилацетат - метанол - вода (20:4:20). Концентрации компонентов А-695 определяли по методу Rachev et al. [11] с последующей денситометрией на спектрометре "Shimadzu CS 930" при длине волны 441 нм. В качестве контроля использовали стандартные растворы актиномицина D.

Результаты и обсуждение

После протопластирования и регенерации культур штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 и его вариантов 695-3-2 и 695-3-2-206 были отобраны и проверены на способность к биосинтезу антибиотика A-695 соответственно 106, 100 и 162 варианта. Полученные данные, подвергнутые статистической обработке, представлены на рис. 1-3. Антибиотическая активность дикого штамма 695 была в пределах 60-120% от активности популяции. Протопластирование приводило к возникновению вариантов, активность которых колебалась от 20 до 140% по сравнению с исходным штаммом. Число вариантов с пониженным уровнем активности в общей популяции было невелико (8%), появились и варианты (6%) с активностью, составляющей 120-140% по сравнению с контролем (рис. 1). При статистическом анализе распределения значений антибиотической активности у отдельных колоний штамма 695-3-2 и регенерировавших протопластов выявлено, что коэффициент вариации возрос с 8,5% до 33,2%. Увеличение коэффициента вариации происходит за счет появления как неактивных, так и более активных по сравнению с исходным штаммом вариантов (рис. 2). Естественная изменчивость штамма 695-3-2-206 по признаку антибиотикообразования была относительно высокой (40-120%). После протопластирования изменение антибиотической активности произошло за счет уменьшения количества низкопродуктивных вариантов и появления вариантов с активностью, составляющей 120-140% по сравнению с контролем (рис. 3).

Рис. 1. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695 (a) и его регенерировавших протопластов (б).
Здесь и на рис. 2 и 3: по оси абсцисс - активность по отношению к средней для исходной культуры (в %); по оси ординат - количество вариантов (в %).
Рис. 2. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695-3-2 (а) и его регенерировавших протопластов (б).
Рис. 3. Распределение значений антибиотической активности штамма S.galbus (F) subsp. achromogenes 695-3-2-206 (а) и его регенерировавших протопластов (б).

Методами спектрофотометрии и ТСХ обнаружено, что в популяции регенерировавших протопластов штамма 695 присутствуют в основном варианты с измененным соотношением компонентов А-695: содержание АМ1 увеличено (до 68%) за счет уменьшения количества АМ2 (табл. 1). Получение и регенерация протопластов дикого штамма оказывают на биосинтез разных компонентов А-695 такое же воздействие, как комбинированный эффект УФ-облучения и нитрозогуанидина - соотношение компонентов становилось таким же, как у штамма 695-3-2-206. Среди ревертантов штамма 695 отобран вариант 695-Р24, биосинтетическая активность которого в 2 раза превышает активность исходного штамма. Влияние повторного протопластирования на антибиотическую активность этого варианта было незначительным, но состав антибиотического комплекса изменялся существенно. В актиномициновом комплексе многих ревертантов обнаружен четвертый компонент - АМ1$\alpha$ (Rf 0,35). Его количество в антибиотическом комплексе было относительно высоким - вторым после АМ1 (см. табл. 1).

Таблица 1. Соотношение компонентов актиномицинового комплекса у вариантов, полученных после протопластирования штамма 695
N варианта Kомпоненты, %
АМ1 АМ2 АМ3 Новая фракция АМ1$\alpha$
695 (K) 31,23 58,63 10,14  
Р2 68,14 28,50 3,36
Р6 30,54 43,78 25,68
Р15 45,70 44,15 10,15
Р25 55,77 23,90 20,33
Р40 61,22 29,66 9,12
Р45 46,65 39,50 13,85
Р51 64,08 30,12 5,80
Р24 42,46 40,06 17,48
Р2411 40,14 21,05 16,61 22,20
Р2415 54,63 8,38 3,33 33,66
Р2417 42,10 17,13 8,85 31,92
Р24100 52,04 16,32 9,98 21,66
Р24112 40,27 14,73 13,03 31,97
Р24114 47,77 21,98 13,29 16,96
Р24126 42,85 17,54 11,10 28,51
Р24127 39,08 19,85 13,26 27,81
Р24128 43,13 42,48 14,39  
Р24129 48,00 29,22 22,78
Р24135 55,21 28,55 16,24
Примечание. Значения Rf для АМ1 - 0,25, АМ2 - 0,41, АМ3 - 0,51 и для фракции АМ1$\alpha$ - 0,35.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования