Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Ионы кальция и дифференциация Streptomyces hygroscopicus 155, продуцента антибиотического комплекса

Мончева П.А., Данова С.Т., Гочева Я., Иванова И.В.

Биологический факультет Софийского университета им. Св. Кл. Охридского, Болгария

В начало...


Исследовано влияние Са2+ на дифференциацию штамма Streptomyces hygroscopicus 155 и его неактивного варианта S.hygroscopicus 155-0. Добавление в среду ионов Са2+ индуцировало формирование воздушного мицелия у неактивного варианта штамма и усиливало образование воздушного мицелия у родительского штамма. Ингибирующее действие ЭГТА, верапамила, нифедипима, хлорпромазина и дилтиазема на формирование воздушного мицелия доказывает физиологическую роль ионов кальция в этом процессе. Добавление в среду "собственных" антибиотиков пандавира (нигерицин) и азаломицина B индуцировало формирование воздушного мицелия у неактивного варианта. Это действие усиливалось в присутствии Са2+ в среде. S.hygroscopicus 155 и его неактивный вариант синтезируют протеолитический комплекс, включающий металлопротеазы и трипсинподобные протеазы. Общая протеолитическая активность неактивного штамма была на более низком уровне по сравнению с родительским штаммом. Добавление Са2+ стимулировало протеолитическую активность штаммов. Индуцирующая роль продуцируемых родительским штаммом антибиотиков на дифференциацию S.hygroscopicus 155-0, а также усиление их действия в присутствии Са2+ дают основание предположить, что они являются регуляторами дифференциации, а эта их функция экспресируется через Са2+-сигнальную систему.

Ключевые слова:

Streptomyces hygroscopicus, ионы кальция, модуляторы Са2+-сигналов, протеазы дифференциации, антибиотики, протеазы регуляции.

Жизненный цикл стрептомицетов, развивающихся на твердых питательных средах, включает последовательное формирование двух типов мицелия - субстратного, а затем воздушного мицелия, на котором формируются споры.

Клеточная дифференциация стрептомицетов регулируется различными эндогенными соединениями, такими как А-фактор и фактор С [1,2].

Для многих стрептомицетов процессы клеточной дифференциации тесно связаны с продукцией вторичных метаболитов, таких, например, как антибиотики. В литературе имеются данные о том, что мутанты ряда стрептомицетов - продуцентов антибиотиков утрачивают способность формировать воздушный мицелий, а также синтезировать антибиотик. Известно также, что физиологическая и морфологическая дифференциация стрептомицетов тесно связана с источниками азота, а внеклеточные протеазы участвуют в ассимиляции внешних белковых источников азота [3]. Несмотря на то, что точные механизмы и роль протеаз в развитии и дифференциации не выяснена, доказано, что сериновые протеазы, образующиеся в стационарной фазе культурами Streptomyces peuceticus и Streptomyces lactamdurans, участвуют в регуляции процессов вторичного метаболизма и морфогенеза.

Известно, что ионы кальция регулируют большое число биологических процессов и их воздействие реализируется посредством взаимодействия с Са2+-связывающими белками. Большое количество кальция накапливается в бактериальных спорах во время споруляции [4-6]. Кальций играет определенную роль и при проростании спор. Установлено, что Са2+ индуцирует формирование воздушного мицелия у Streptomyces ambofaciens и Streptomyces alboniger [7, 8]. Ранее нами было установлено, что Cа2+ индуцирует или стимулирует формирование воздушного мицелия у многих актиномицетов, в том числе у стрептомицетов [9, 10]. Изучение роли ионов кальция в дифференциации стрептомицетов представляет особый интерес у продуцентов антибиотиков, так как у большинства из них отсутствие дифференциации связано с потерей способности к антибиотикообразованию.

Цель настоящего исследования - изучение влияния ионов кальция на процессы дифференциации у Streptomyces hygroscopicus 155 - продуцента антибиотика пандавира (нигерицина) и азаломицина В и у его неактивного варианта Streptomyces hygroscopicus 155-0, а также изучение роли внеклеточных протеаз в этих процессах.

Материал и методы

Микроорганизмы. Использовали штамм S.hygroscopicus 155 из коллекции кафедры общей и промышленной микробиологии Биологического факультета Софийского университета, являющийся продуцентом пандавира (идентичного нигерицину) и азаломицина В [11, 12]. Неактивный вариант штамма был изолирован при естественном рассеве родительского штамма и обозначен S.hygroscopicus 155-0. На средах, не содержащих ионов кальция, S.hygroscopicus 155-0 не формирует воздушного мицелия.

Среды и условия культивирования. Для поддержания штаммов стрептомицетов использовалась среда Гаузе N 1. В зависимости от цели исследования микроорганизмы культивировали на твердой среде (в виде плотного посева) и в жидкой питательной среде. Температура культивирования 28 њС. Глубинное культивирование S.hygroscopicus 155 и его варианта было осуществлено в два этапа в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл, содержащих 100 мл среды, на ротационной качалке (220 об/мин). Количество посевного материала, использованного для инокулирования посевной среды, составило 1% (суспензия спор 109/мл). Количество инокулюма для посева ферментационных сред составило 5% (вегетативный мицелий). Продолжительность культивирования была различной в зависимости от цели эксперимента.

Для изучения влияния Са2+ на образование воздушного мицелия в качестве основной среды была использована среда Гаузе N 1. Кальций в виде CaCl2 вносили двумя способами: непосредственно в культуральную среду или нанесением на бумажные диски. Эффект модуляторов кальциевых сигналов - ЭГТА (этиленгликоль тетраацетат) ("Sigma"), нифедипина, верапамила, дилтиазема и хлорпромазина ("Fluka"), пандавира, азаломицина В, монензина и салиномицина на формирование воздушного мицелия изучали методом бумажных дисков. На бумажные диски наносили соответствующие количества стерильных растворов этих веществ, после чего их помещали на поверхность среды Гаузе N 1, инокулированной штаммами, в чашках Петри.

Определение внеклеточной протеолитической активности. Культуральные среды с мицелием S.hygroscopicus 155 или его неактивным вариантом центрифугировали 10 мин при 1000 g, полученный супернатант был использован для определения активности ферментов.

Общую протеазную активность определяли методом M. Kunitz [13]. В качестве субстрата был использован казеин (10 мг/мл). При этом одна единица определяется как количество фермента, которое в процессе реакции вызывает изменение абсорбции, равное 0,001.

Определение гидролиза синтетического субстрата N-бензоил-аргинин-п-нитроанилида (БАПНА) проводили путем измерения количества количества п-нитроанилида, высвобожденного из этого субстрата. Метод подробно описан в предыдущей работе [14]. Одна энзимная единица определялась как количество энзима, необходимое для образования 1 мкмоля п-нитроанилида за 1 мин [15].

Изучено влияние следующих протеазных ингибиторов на протеолитическую активность: трипсинового ингибитора (Soybean), ЭДТА и ЭГТА методом, описанным S. Kang et al. [16]. Определение белка. Концентрации белка в фильтратах культуральной жидкости определяли по методу Лоури [17].

Результаты и обсуждение

Изучено влияние Са2+ и ЭГТА на формирование воздушного мицелия у S.hygroscopicus 155 и его неактивного варианта S.hygroscopicus 155-0. Ионы Са2+ (10 мМ кальция хлорида) были добавлены в среду. ЭГТА использовали после нанесения на бумажные диски. Результаты представлены в табл. 1. Полученные данные свидетельствуют, что ионы Са2+, добавленные в среду, индуцируют формирование воздушного мицелия у неактивного варианта родительского штамма. На среде без кальция данный вариант не обладает способностью к морфологической дифференциации. Ионы кальция усиливают образование воздушного мицелия и у родительского штамма. Для доказательства индуцирующего (или стимулирующего) влияния ионов кальция на формирование воздушного мицелия исследовали влияние ЭГТА (3 мкмоля/диск). Известно, что ЭГТА является специфическим хелатирующим агентом (Са2+-хелатор). В обоих штаммах ЭГТА подавлял формирование воздушного мицелия. Ингибирующее действие ЭГТА на формирование воздушного мицелия доказывает физиологическую роль ионов кальция в этом процессе.

Таблица 1. Влияние Са2+ и ЭГТА на формирование воздушного мицелия у S.hygroscopicus 155 и S.hygroscopicus 155-0
Штаммы Формирование воздушного мицелия
среда Гаузе N 1 (контроль) индуцирование (стимуляция) Са2+ (10 мМ) ингибирование ЭГТА (3 мкмоль/диск)
S.hygroscopicus 155 + + +
S.hygroscopicus 155-0 - + +

Ингибирование формирования воздушного мицелия у исследованных штаммов верапамилом, нифедипином, дилтиаземом и хлорпромазином в использованных концентрациях подтверждает эту важную функцию ионов кальция (табл. 2). Известно, что верапамил, нифедипин и дилтиазем являются блокаторами кальциевых каналов, а хлорпромазин - ингибитором кальмодулиновых протеинов. Наиболее выраженный ингибирующий эффект проявляли хлорпромазин и нифедипин. Эти соединения ингибируют формирование и субстратного мицелия. Аналогичные результаты были получены для S.alboniger [8] и для некоторых других стрептомицетных штаммов, изученных нами ранее [9, 10].

Таблица 2. Влияние модуляторов Са2+-сигналов на формирование воздушного (субстратного) мицелия S.hygroscopicus 155 и S.hygroscopicus 155-0
Штаммы Блокаторы Са2+-каналов Ингибитор кальмодулинов Са2+-хелатор
верапамил (1 мкмоль/диск) нифедипин (1 мкмоль/диск) дилтиазем (2 мкмоль/диск) хлорпромазин (0,2 мкмоль/диск) ЭГТА (3 мкмоль/диск)
S.hygroscopicus 155 19 20 (12) 15 (10) 38 (10) 23
S.hygroscopicus 155-0 20 23 (14) 16 (15) 40 (10) 27

Ингибирующий эффект верапамила, нифедипина и дилтиазема подтверждает существенную роль экзогенного кальция, поступающего в клетку через кальциевые каналы, для индуцирования (или стимулирования) формирования воздушного мицелия. Влияние хлорпромазина на формирование воздушного мицелия дает основание предполагать, что в исследованных нами штаммах вероятно функционируют кальмодулин-подобные протеины, которые реализуют регуляторную функцию кальциевых ионов на процессы дифференциации стрептомицетов.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования