Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посмотрите новые поступления ... Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Лабораторная и функциональная диагностика | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Научные статьиДисомия хромосом в половых клетках мужчин при нарушении сперматогенеза: дисомия по половым хромосомам

Преимплантационная генетическая диагностика: современное состояние и последние научные открытия

Материалы II Международного конгресса по преимплантационной генетике (18-21/IX 1997 г. Чикаго, США)

И.К. Гоголевская

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва

Редакция выражает компании <Органон> признательность за возможность использования сети INTERNET-MEDLINE при подготовке этого обзора.

Проблемы репродукции, N1-1999, с.19-26

В начало...


Представлены основные достижения фундаментальных и клинических исследований в области преимплантационной генетики, а также опыт по применению преимплантационного генетического диагноза в клинической практике.

Ключевые слова:

полярное тельце (ПТ), полимеразная цепная реакция (ПЦР), флюоресцентный ПЦР-анализ (Ф-ПЦР), флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), полиморфные короткие тандемные повторы (STRs), мРНК, кДНК-библиотека.

Идея применения методов преимплантационной генетики в клинической практике возникла давно. Еще в 1967 г. R.Edwards и R.Gardner успешно определяли пол у эмбрионов кролика, находящихся на стадии бластоцисты, и затем переносили их в полость матки [1]. Уже тогда эти ученые предсказывали применение аналогичных технологий у человека во избежание передачи наследственных заболеваний от родителей детям. Однако это стало возможным лишь в начале 90-х годов, когда была разработана техника полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая позволяла определять мутации в единичных клетках [2]. Первыми ПЦР для преимплантационной генетической диагностики (ПГД) в клинической практике применили А.Handyside и соавт. в 1990 г. С помощью ПЦР они детектировали специфические последовательности для хромосомы Y при определении пола эмбрионов у супружеских пар с X-сцепленными заболеваниями [3]. Однако из-за риска постановки неправильного диагноза при определении пола эмбрионов от ПЦР постепенно стали отказываться в пользу другого метода - флюоресцентной (нерадиоактивной) гибридизации in situ (FISH). Его преимущество заключалось в том, что можно было одновременно детектировать как X-, так и Y-хромосомы, и, как следствие, появилась возможность определять не только пол эмбрионов, но и анеуплоидии половых хромосом [4]. С тех пор за достаточно короткое время разработано много модификаций ПЦР и FISH, расширяется область применения этих методов в ПГД. В сентябре 1997 г. в Чикаго проходил симпозиум по преимплантационной диагностике, где были представлены новейшие разработки в области ПГД и результаты применения их в клинической практике.

ПГД с применением FISH

В настоящее время FISH применяется в большинстве ПГД центрах мира как предпочтительный метод при определении пола в случаях предупреждения передачи X-сцепленных рецессивных заболеваний. Однако, как считают ученые, FISH следует применять в программах ЭКО для всех женщин старшей возрастной группы. Установлено, что морфологически нормальные эмбрионы, полученные после проведения ЭКО у таких женщин, имеют значительное повышение анеуплоидий, которые могут приводить к спонтанным абортам или к отсутствию имплантации [5]. Кроме того, при использовании FISH в ПГД установлено, что хромосомный мозаицизм является общим явлением у эмбрионов на стадии дробления [6]. Было показано, что у фертильных супружеских пар анеуплоидии и/или мозаицизм эмбрионов встречаются с частотой 40-80% [7]. Это открытие имело важное значение для диагностики заболеваний, связанных с доминантными мутациями в единичных генах, моносомиями, трисомиями, а также для понимания развития человека на ранних эмбриональных стадиях.

Так как большинство анеуплоидий материнского происхождения и возникают они в результате нерасхождения хромосом во время мейоза I, в дальнейшем было предложено для их детекции использовать хромосомы первого полярного тельца (1ПТ). Анализ ПТ в сочетании с биопсией бластомеров позволил бы в дальнейшем выявлять анеуплоидии, унаследованные от отца.

Y.Verlinsky и соавт. [8] провели генетическое тестирование ооцитов с анеуплоидиями у включенных в программу ЭКО пациенток старше 34 лет, анализируя с помощью FISH 1ПТ и 2ПТ. При детектировании общих анеуплоидий применяли микроманипуляционные методы, удаляли ПТ у 363 женщин и исследовали их с помощью FISH, используя специфические зонды для хромосом 13, 18 и 21. В 538 ЭКО циклах было извлечено 3250 ооцитов; результаты по FISH были получены для 2742 (84,3%) ооцитов. У 1102 (40%) ооцитов детектировали анеуплоидии (при этом анеуплоидными были 33,7% 1ПТ и 24,9% 2ПТ). Большинство анеуплоидий были представлены недостающими (в основном в 1ПТ) или лишними хроматидами (в основном во 2ПТ). Аномалии 793 1ПТ представлены следующим образом: 52,2% - отсутствие хроматид; 8,2% - отсутствие хромосом; 16,1% - лишние хроматиды; 1,3% - лишние хромосомы; 19,2% - другие различные типы аномалий. Аномалии 556 2ПТ представлены: 46,6% - лишние хроматиды; 41,7% - недостающие хроматиды. Из 1640 ооцитов, детектированных как нормальные, 1298 были перенесены, получено 107 беременностей, родилось 67 здоровых детей, 32 - спонтанных аборта, 15 - продолжающихся на момент исследования беременностей с подтвержденным нормальным диагнозом. Частота беременности на перенос составила 26,8% для циклов, в которых ооциты отбирали на основе FISH анализа 1ПТ и 2ПТ по сравнению с 20,7%, где проверяли только одно ПТ [8].

Носители транслокаций чаще страдают бесплодием, у них могут случаться спонтанные аборты или рождаться дети с хромосомными аномалиями. Проблемы, связанные с транслокациями, частично решаются с помощью ПГД. Так, после проведения ПГД для определенных транслокаций родились здоровые дети [9]. Для ПГД транслокаций применяются два подхода. Первый подход заключается в разработке и применении специфических зондов для каждого типа транслокаций, эта дорогостоящая методика и на нее затрачивается много времени. С помощью специфических зондов уже детектируются робертсоновские транслокации [10]. Однако такие зонды не могут дифференцировать нормальные эмбрионы от сбалансированных. Последние не подходят для переноса, потому что являются носителями генетических заболеваний в семье и часто имеют тенденцию к спонтанным абортам. Второй подход используется, когда носителем транслокаций является женщина. На препаратах хромосом 1ПТ, находящихся на стадии метафазы, проводят гибридизацию in situ с применением зондов, специфических для определенных хромосом (зонды метятся флюоресцентной меткой разного цвета).

S. Munne и соавт. использовали второй метод для 7 супружеских пар, в которых женщины являлись носителями одной из нижеперечисленных транслокаций: 45,XX,der (13q;14q)(q10;q10) (2 случая); 46,XX,t(4;14)(p15.3;q24); 45,XX,der (14q;21q)(q10;q10); 46,XX,t(7;20)(q22;q11.2); 46,XX,t(9,11)(p24;q12). Метод был усовершенствован: во-первых, для избежания постановки неправильного диагноза в результате ошибочной идентификации хромосомных моновалентов 1ПТ (каждый из которых состоит их двух хроматид) с единичными хроматидами использовали зонды к центромерным областям для одной или обеих хромосом, вовлеченных в транслокацию; во-вторых, для случаев с теломерными транслокациями, когда при гибридизации зонды не захватывали последовательности теломер, использовали меченые зонды на теломерные области. Всего было проверено 26 анормальных, 18 сбалансированных и 22 нормальных яйцеклетки. 9 нормальных и 7 сбалансированных эмбрионов были перенесены, при этом в 8 (50%) случаях произошла имплантация, из которых в 1 случае имел место спонтанный аборт. В остальных случаях родились дети с нормальным кариотипом. Частота спонтанных абортов после ПГД (12,5%) была значительно ниже (p<0,001) по сравнению с естественными циклами для пациентов с аналогичными проблемами [11].

M.Magli и соавт. для одновременной детекции хромосом Х, Y, 13, 16, 18 и 21 применяли FISH с различными флюоресцентными красителями. Критериями отбора пациенток были: возраст матери старше 36 лет, 3 и более предварительных неудачных ЭКО цикла, измененный кариотип. Из 412 эмбрионов, проверенных с помощью FISH, у 234 (57%) были анормальные хромосомы. Эмбрионы с нормальным кариотипом были перенесены 59 пациенткам, получено 19 (32%) беременностей с частотой имплантации 19,9% [12].

D.Manor и соавт. с помощью ПГД проверили 63 эмбриона, полученных в 29 циклах. Показаниями для проведения ПГД были возраст матери старше 39 лет, X-сцепленные заболевания, плохого качества эмбрионы, повторные неудачные ЭКО циклы, быстроделящиеся эмбрионы. 38 дополнительных эмбрионов с несоответствующим размером ядра были проверены на плоидию. Биопсия бластомеров проводилась, когда эмбрионы находились на 6 - 8 клеточной стадии. Для детекции анеуплоидий применяли 5 флюоресцентных зондов для хромосом Х, Y, 13, 18 и 21. Проверенные 84 (87%) бластомера от 73 эмбрионов показали нормальные сигналы. В 5 бластомерах ядра не были выявлены, тогда как в 9 бластомерах обнаружено более чем 1 ядро. 32 эмбриона были перенесены 10 пациенткам. Получены 2 беременности. Родились 2 здоровых ребенка. 56% быстроделящихся эмбрионов дали нормальные сигналы при гибридизации. В двух группах эмбрионов с неправильным размером ядра 50 и 11,4% эмбрионов соответственно продемонстрировали нормальные сигналы. Эффективность FISH при детекции анеуплоидий составила 87 и 97% для аутосом и половых хромосом соответственно [13].

F.Vidal и соавт. с помощью FISH детектировали анеуплоидии для хромосом 13, 16, 18, 21, 22, Y и Х у преимплантационных эмбрионов от 3 пациенток с эмбриональными потерями неясного генеза. Была проведена биопсия 39 эмбрионов, находящихся на 8-клеточной стадии. Анализ бластомеров показал, что хромосомы 17 эмбрионов были нормальными, анеуплоидию наблюдали у 16 эмбрионов и для 6 эмбрионов был получен неоднозначный результат [14].

S.Smith и соавт. у 14 супружеских пар в ЭКО циклах получили 134 эмбриона. Используя одновременно набор ДНК-зондов для хромосом Х, Y, 13, 18 и 21 в сочетании с локус-специфическими ДНК-зондами, авторы выполняли FISH для вышеперечисленных хромосом, выделенных из бластомеров, которые были получены посредством биопсии эмбрионов. FISH-анализ показал, что 22% эмбрионов были нормальными по этим хромосомам, 52% - анормальными и для 25% эмбрионов не могли получить однозначного результата. Для 12 пар был выполнен перенос, у 2 пар перенос не был осуществлен из-за отсутствия нормальных эмбрионов. Беременность наступила в 3 парах [15].

Новые разработки в FISH-технологии

Однако существует три основных ограничения при выполнении FISH для ПГД:

1) FISH ограничивается диагнозом на хромосомном уровне, а не на уровне единичного гена;

2) потеря ядер при приготовлении препаратов бластомеров;

3) время, затраченное для постановки диагноза.

Новыми, альтернативными методами установления пола в единичных клетках, детектирования анеуплоидий и дефектов определенных генов являются методы PRINS и флюоресцентный ПЦР-анализ (Ф-ПЦР). PRINS сходен с методикой FISH, за исключением того, что он не требует предварительного мечения зонда, так как реакция мечения происходит in situ [16].

В процессе отжига олигонуклеотиды формируют гибриды с комплементарными последовательностями и затем действуют как праймеры для синтеза меченой ДНК. Так как олигонуклеотиды немеченые, это приводит к низкому фону. Недавно PRINS использовали для определения пола на эмбрионах человека, и эксперимент дал многообещающие результаты [17].

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования