Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Патологическая биохимия | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Биологическое тестирование дисфункцинов, извлеченных ликворосорбцией у больных героиновой наркоманией

П.А. Пирумов, В.Г. Шаляпина, А.А. Мокрушин, Д.Ю. Романовский

Городская больница N 32, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

В начало...


Борьба с наркотической зависимостью составляет сейчас одну из главных задач практической медицины, особенно когда врачу приходится иметь дело с больными, поступающими в лечебное учреждение в состоянии формирующейся абстиненции. Одним из способов экстренной помощи в этих случаях является ликворосорбция, которая позволяет провести быструю детоксикацию и избавить больного от развивающегося абстинентного синдрома. Из спинномозговой жидкости (СМЖ) при этом удаляются токсичные соединения, которые были названы <дисфункцинами> [1], и именно они могут быть использованы для изучения химического состава и физиологических эффектов тех факторов, которые накапливаются в мозге и СМЖ при наркомании.

Задачей данного исследования явились изучение эффектов выделенных при ликворосорбции дисфункцинов на базисные электрофизиологические характеристики переживающих срезов мозга крыс и анализ зависимости этих эффектов от концентрации изучаемых агентов в среде.

В конкретные задачи исследования входило: 1) исследовать динамику изменений пре- и постсинаптических процессов: потенциала действия латерального обонятельного тракта (ЛОТ), неN-метил-D-аспартатных (неНМДА) и N-метил-D-аспартатных (НМДА) компонентов возбуждающего постсинаптического потенциала (ВПСП), медленного тормозного постсинаптического потенциала (ТПСПм), входящих в состав фокального потенциала (ФП); 2) проанализировать концентрационные зависимости эффектов препаратов; 3) изучить степень обратимости действия препаратов в ходе отмывания.

Сеансы ликворосорбции проводили у 18 пациентов с героиновой наркоманией в возрасте от 17 до 25 лет, находившихся в стадии абстиненции. Были использованы препараты, полученные после первого сеанса сорбции. В одну пробу объединялся материал от 6 больных. Работа была выполнена на 3 подобных препаратах. Массообменники (колонки с ликворосорбентом) отмывали от СМЖ 150 мл дистиллированной воды, подаваемой со скоростью 50 мл/мин, затем для элюции сорбированных веществ в колонку вводили 3 мл 0,05 М спиртового раствора аммиака. Элюат переносили в пробирки, которые помещали в вакуумный сушильный шкаф, и после высушивания активную фракцию извлекали 96% этанолом в объеме 1 мл. Спирт испаряли и препараты хранили в холодильнике до тестирования.

С целью изучения физиологических эффектов дисфункцинов были использованы переживающие срезы обонятельной коры мозга крыс, которые успешно применяются при оценке действия биологически активных веществ и фармакологических препаратов [2]. Использование данного метода подробно описано ранее [5, 8].

В работе были использованы тангенциальные переживающие срезы толщиной 400-500 мкм обонятельной коры мозга крыс-самцов линии Вистар. Состав инкубационной среды (в ммоль): NaCl - 124, KСl - 5, CaCl2 - 2,6, КН2РО4- 1,24, MgSO4 - 1,2, NaHCO3 - 3, глюкоза - 10, трис-HСl-буфер - 23. Раствор тщательно насыщали кислородом, температуру поддерживали на уровне 37њС; рН 7,2-7,3. Срезы перфузировали со скоростью 2 мл/мин. Тестируемые препараты непосредственно перед опытом растворяли в инкубационной среде в соотношении 1:5 или 1:7.

До начала тестирования в срезах регистрировали контрольные ФП на одиночные раздражения ЛОТ с интервалом 3 мин. Затем перфузия переключалась на среду с одним из тестируемых препаратов. Длительность тестирования составляла 20 мин. В течение этого времени с интервалом 5 мин регистрировали ФП в ответ на одиночные раздражения ЛОТ, далее в течение 15 мин проводили отмывание срезов контрольной средой. Регистрацию ФП при отмывании проводили с теми же параметрами стимуляции, что и при тестировании.

Анализировали амплитуды возбуждающих и тормозных процессов, имеющих различные механизмы генеза и реализуемых через разные рецепторные механизмы. Возбуждающие процессы характеризовались пресинаптическим компонентом - потенциалом действия ЛОТ, свидетельствующим о прохождении возбуждения по волокнам ЛОТ, и двумя постсинаптическими компонентами, состоящими из ионотропного неНМДА-компонента ВПСП, связанного с активацией $\alpha$-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовых(АМПА) рецепторов, и НМДА-компонента ВПСП, реализуемого ионотропными НМДА-рецепторами [6, 7]. Для характеристики тормозного процесса регистрировали и анализировали медленный ТПСПм, возникающий благодаря активации ГАМКВ-рецепторов и открытию хлорных каналов [9].

В работе представлены усредненные данные амплитуд различных компонентов ФП за все время тестирования и отмывания. Статистические различия оценивали по t-критерию.

При изучении электрической активности переживающих срезов были выявлены вполне закономерные эффекты дисфункцинов, хотя и по-разному выраженные у изучаемых препаратов. В малой концентрации (разведение 1:7) два препарата (2 и 3) угнетали амплитуду АМПА и НМДА-компонентов ВПСП, в то время как при добавлении в среду препарата 1 в той же концентрации происходило увеличение амплитуды НМДА-компонента и снижение активности ГАМКв тормозного потенциала. Для этого препарата оказалось характерным увеличение амплитуды НМДА-компонента ВПСП и ТПСПм при увеличении его содержания в среде инкубации (разведение 1:5), что говорит о том, что этот препарат характеризуется потенцирующим эффектом. В то же время препараты 2 и 3 при аналогичном возрастании доз сохраняли ингибиторное влияние на амплитуду НМДА-компонентов ВПСП, хотя препарат 2 несколько увеличивал при этом и аксональную возбудимость.

Таким образом, изменения, вызываемые изученными препаратами, оказались пропорциональными их концентрации, однако вектор направленности данных эффектов различался. Это свидетельствует о том, что состав дисфункцинов, извлеченных из СМЖ больных наркоманией, может быть гетерогенным и содержать как возбуждающие, так и тормозные вещества. Судя по полученным данным, в них содержатся молекулы, которые способны угнетать активность ионотропных глутаматных рецепторов обоих типов, вызывая тем самым депрессию нейрональной активности.

Эффекты обратимости анализировали при отмывании срезов в течение 15 мин инкубационной средой. Действие препаратов 2 и 3 в меньшей концентрации (1:7) после этого не снималось. У препарата 1 обратимость эффекта при разведении 1:7 оказалась полной для всех компонентов ФП, а при действии большей концентрации (1:5) угнетенным оставался лишь ТПСПм. Препараты 2 и 3 в большей концентрации (1:5) повышали аксональную возбудимость волокон ЛОТ. Постсинаптические компоненты ФП при отмывании препарата 2 в этой же концентрации менялись асинхронно: АМПА-компонент ВПСП и ТПСПм угнетались, тогда как НМДА-компонент ВПСП не изменялся. Обратимость эффектов препарата 3 выражалась в увеличении всех компонентов ФП. Следовательно, за 15-минутный период отмывания не происходило полного восстановления амплитуд компонентов ФП, что, с нашей точки зрения, свидетельствует о пролонгированном действии выделенных веществ на механизмы внутриклеточной сигнализации.

В следующей серии опытов использовали препараты, полученные при ликворосорбции со сменным массообменником. При этом основной сеанс сорбции длился, как обычно, 1,5 ч, а затем была подключена новая капсула с сорбентом и сорбция продолжалась еще 30 мин. Таким путем мы пытались ответить на вопрос о степени эффективности сорбции и создать простой тест-прием, характеризующий качество выполняемой процедуры. Исследования подтвердили наши предположения и показали, что первичный препарат ликворосорбции вызывает достоверное (р<0,05) снижение амплитуды АМПА и НМДА-компонентов ВПСП. В то же время вторичный препарат, полученный после завершения сеанса обычной процедуры, этим эффектом не обладал и не вызывал сколько-нибудь значимых изменений электрической активности тестируемых срезов обонятельной коры мозга крыс. При отмывании этих срезов, однако, выявлялось достоверное угнетение амплитуд обоих компонентов ВПСП, что характерно для действия нейропептидов на электрическую активность срезов [8].

Исходя из результатов наших исследований можно заключить, что при ликворосорбции из СМЖ удаляются дисфункцины с выраженным нейротропным эффектом. Анализ этих влияний на переживающих срезах коры мозга говорит о том, что действие веществ, которые накапливаются в мозге и СМЖ, направлено как на возбуждающие, так и на тормозные процессы, причем в стадии развития абстиненции преобладают ингибиторные влияния. Это подтверждено нами и в опытах на целом животном при изучении его ориентировочно-исследовательского поведения. В опытах in vitro удалось понять, что эффект данной группы факторов направлен как на пре-, так и на постсинаптические механизмы проведения возбуждения с наибольшей выраженностью на синаптическом уровне. При этом следует подчеркнуть наибольшую подверженность действию дисфункцинов НМДА глутаматергических механизмов синаптической передачи, с которыми связаны в основном пластические перестройки в мозге [4]. Однако изменение амплитуды ТПСПм компонента ФП свидетельствует о том, что в препаратах присутствуют вещества, которые активно воздействуют на ГАМКB-рецепторы и сопряженные с ними хлорные каналы. Такое разнообразие эффектов, исходя из нашего опыта, присуще регуляторным пептидам.

При анализе нейрофизиологических эффектов дисфункцинов естественно возникает вопрос об их специфичности, и для ответа на него было бы целесообразно протестировать элюэнты, полученные при проведении ликворосорбции у больных с какой-либо иной формой патологии (эпилептическая активность, мозговой инсульт, травма мозга и др.) и у здоровых добровольцев.

Проведенное исследование показало, что использованный нами метод [3] позволяет очистить СМЖ от вызывающих абстиненцию веществ, а примененная тест-система оценки нейрональной активности тех или иных препаратов на переживающих срезах головного мозга теплокровных животных является достаточно чувствительной и надежной.


Журнал неврологии и психиатрии N 9-2000, стр.61-62

Литература

1. Васильев В.Ю., Иванова И.Б., Нестеров Н.Н. и др. Вестн Санкт-Петербургского университета: Сер. биол. 1998; 1: 25-31.

2. Митюшов М.И., Емельянов Н.А., Мокрушин А.А. и др. Переживающий срез мозга как объект нейрофизиологического и нейрохимического исследования. Л 1986; 127.

3. Михайлова Н.Г., Рещиков А.М., Токалов С.В. и др. Журн неврол и психиатр 1998; 98: 6: 32-34.

4. Мокрушин А.А. Пептидзависимые механизмы нейрональной пластичности в обонятельной коре: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Ст-Петербург 1997.

5. Мокрушин А.А., Мусящикова С.С. Изв АН СССР: Сер. биол. 1989; 4: 556-565.

6. Hoffman W.H., Haberly L.B. J Neurosci 1989; 9: 1: 206-215.

7. Jung M.W., Larson J., Lynch G. Exp Brain Res 1990; 82: 5: 451-455.

8. Mokrushin A.A., Emelyanov N.A. Neuropeptides 1991; 20: 1: 87-94.

9. Tseng G.-F., Haberly L.B. J Neurophysiol 1988; 59: 5: 1352-1376.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования