Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Расширение органоспецифичности действия полинуклеотидных индукторов интерферона

Аксенов О.А., Платонова Г.А., Тимковский А.Л.

НИИ детских болезней РАМН, Санкт-Петербург; Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург; Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина, Ленинградская обл.

В начало...


Сопоставлены титры интерферона в крови и мозгу мышей и их защита от вируса герпеса после введения дуплекса поли(Г)ћполи(Ц) - нативного и модифицированного цис-диаммин-дихлорплатиной(II). Показано, что платинирование дуплекса, в особенности на уровне нити поли(Г), приводит к резкому повышению титров индуцированного интерферона в экстрактах мозга животных и к перераспределению типов индуцированного в мозгу интерферона в сторону преобладания $\gamma$-интерферона. Показатели интерфероногенеза коррелируют с защитной активностью дуплексов против вируса герпеса. Сделан вывод, что наличие связанной платины может повышать мембранную специфичность дуплекса и облегчать его проникновение через гематоэнцефалический барьер. Обсуждаются возможные структурные изменения дуплекса под влиянием двухвалентной платины, приводящие к наблюдаемым эффектам.

Ключевые слова:

поли(Г)ћполи(Ц), индукторы интерферона, вирус герпеса, цис-диаммин-дихлорплатина (II).

Двунитевые природные РНК и дуплексы синтетических полирибонуклеотидов являются высокоактивными индукторами интерферона у теплокровных существ. При введении этих препаратов человеку и животным внутривенно или иным способом, обеспечивающим контакт индукторов с системой кровообращения, в крови обнаруживается накопление интерферона, защищающего организм от последующей инфекции разнообразными вирусами. Это относится в основном к вирусам, заражение которыми происходит также через кровеносную систему - внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно. Благодаря гематоэнцефалическому барьеру, проникновение интерферона и его индукторов в мозг ограничено. Поэтому при заражении нейротоксичными вирусами (например, вирусом герпеса) пути инфекции и циркуляции индуцированного интерферона разобщены. В результате при таких инфекциях защитное действие индукторов интерферона, введенных в кровоток, выражено слабо. Таким образом, можно говорить об органоспецифичности действия полинуклеотидных индукторов интерферона. Расширение такой органоспецифичности могло бы способствовать большей универсальности противовирусного действия индукторов интерферона.

Ранее нами было обнаружено повышение индукции интерферона в крови животных и возрастание противогриппозной активности полирибонуклеотидных дуплексов поли(Г)ћполи(Ц) [1] и поли(А)ћполи(У) [2, 3] при их модификации цис-диаммин-дихлорплатиной(II) (цис-ДДП). В данной работе мы сопоставили титры интерферона в крови и мозгу мышей и их защиту от вируса герпеса после введения нативного и модифицированного цис-ДДП разными способами дуплекса поли(Г)ћполи(Ц).

Материал и методы

Полирибонуклеотиды поли(Г) и поли(Ц) синтезировали соответственно из ГДФ и ЦДФ с помощью коммерческой растворимой полинуклеотидфосфорилазы Escherichia coli (Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ, г. Бердск, Новосибирская обл.). Использовали ГДФ и ЦДФ фирмы "Reanal" (Венгрия), очищенные колоночной хроматографией на анионообменной смоле АРА-5п (Россия). Дуплекс поли(Г)ћполи(Ц) получали смешением эквимолярных количеств поли(Г) и поли(Ц) в 0,005 М Na-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1 М NaCI и прогревом при 80 њС в течение 10 мин. [5]. Полинуклеотиды и дуплексы стандартизовали по разработанным ранее критериям [4]. Использовали цис-ДДП фирмы "Lachema" (Чехия). Дуплекс поли(Г)ћполи(Ц) модифицировали цис-ДДП, как описано ранее [1], при низком уровне модификации (rb = 0,02). Модификацию осуществляли 2 способами: 1) проводили предварительную модификацию поли(Г) с последующим ее взаимодействием с поли(Ц) - получали препарат [поли(Г)ћ(цис-ДДП)]ћполи(Ц) - N 1; 2) модифицировали готовый дуплекс - получали препарат [поли(Г) ћполи(Ц)]ћ(цис-ДДП) - N 2.

Биологическую активность дуплексов изучали на белых беспородных мышах массой 20-25 г или 10-12 г. Для измерения интерферон-индуцирующей активности препараты вводили внутривенно в дозе 20 мкг/мышь. Интерферон титровали методом количественной гемадсорбции в сыворотках крови мышей и в гомогенатах мозга, взятых через разные сроки после инъекции препаратов. Соотношение $\alpha$- и $\gamma$-интерферонов определяли по стандартным тестам на рН- и термостабильность, а также с помощью специфических антисывороток, любезно предоставленных В.И. Иовлевым (НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). Противовирусную активность определяли по отношению к вирусу герпеса I типа (штамм Л-2). Препараты дуплекса вводили внутрибрюшинно или интраназально в дозе 20 мкг/мышь за сутки до внутримозгового инфицирования мышей 100 LD50 вируса. Учет проводили по кумулятивной выживаемости в период 20-100% гибели мышей в контрольной группе. Математическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с расчетом уровня значимости р.

Результаты и обсуждение

В табл. 1 приведены результаты измерения интерферон-индуцирующей и противогерпетической активности модифицированных дуплексов поли(Г)ћполи(Ц) в сравнении с исходным дуплексом. Как и в экспериментах с поли(А)ћполи(У) [3], при модификации цис-ДДП дуплексов поли(Г)ћполи(Ц) существенно (здесь уже в десятки раз) повышался уровень индуцированного интерферона в мозгу животных. Наибольшее увеличение наблюдалось в случае инъекции препарата N 1: суммарный уровень интерферона в экстракте мозговой ткани в течение 2 суток после введения препарата составил 647 ед/мл, т.е. 24% от суммарной концентрации интерферона за то же время в крови. Для препарата N 2 эти показатели были несколько ниже: соответственно 310 ед/мл и 19%. При внутривенном же введении мышам исходного поли(Г)ћполи(Ц) в указанные сроки в мозгу было выявлено суммарно только 60 ед/мл интерферона или около 3% от количества интерферона в крови. Показатели интерфероногенеза коррелировали с защитной активностью дуплексов против вируса герпеса. Наиболее выраженной защитной активностью обладал препарат N 1 - кумулятивная выживаемость составила 71%. Несколько меньшую активность имел препарат N 2 (кумулятивная выживаемость - 62%). Оба препарата превосходили по активности немодифицированный дуплекс (кумулятивная выживаемость 56%). Интересно, что именно модификация дуплекса на уровне нити поли(Г) (препарат N 1) дает наибольший эффект при стимуляции активности на уровне ЦНС. Возможно, что это - проявление достаточно равномерно распределенных центров модификации и нарушений вторичной структуры дуплекса при таком варианте платинирования [1].

Таблица 1. Соотношение между интерферон-индуцирующей и противогерпетической активностями дуплексов поли(Г)ћполи(Ц), модифицированных цис-ДДП
Препарат Уровень продукции интерферона, ед/мл Соотношение $\Sigma$мозг/$\Sigma$кровь Kумулятивная выживаемость мышей, зараженных вирусом герпеса I типа (штамм Л-2)
кровь мозг
через 6 ч суммарно 2-6 и 24-72 ч ($\Sigma$кровь) через 6 ч суммарно 2-6 и 24-72 ч ($\Sigma$мозг) абс. % р
Поли(Г)ћполи(Ц) 624 1758 9 60 0,03 56/100 56,0 -
[Поли(Г)ћполи(Ц)]ћ(цис-ДДП) (N2) 864 1610 165 310 0,19 53/85 62,4 <0,05
[Поли(Г)ћ(цис-ДДП)]ћполи(Ц) (N 1) 762 2710 240 647 0,24 71/100 71,0 <0,01
Плацебо 0 0 0 0 - 32/95 33,7 -
Примечание. Уровень значимости р рассчитан для противовирусной активности модифицированных дуплексов в сравнении с активностью немодифицированного дуплекса.

При анализе типов интерферона, индуцированного препаратом N 1 у молодых мышей, наряду с некоторым повышением титров интерферона в крови и значительным повышением продукции интерферона в мозгу, обнаружено резкое увеличение продукции интерферона $\gamma$-типа (табл. 2). Содержание интерферона $\gamma$-типа достигало 75% от общего количества интерферона в мозгу, в отличие от преобладающей продукции $\alpha$-интерферона (70%) и значительно меньшегообщего количества интерферона в мозгу при действии немодифицированного поли(Г) поли(Ц).

Таблица 2. Соотношение титров интерферона в крови и мозгу молодых мышей (возраст 1-2 недели) после индукции исходным и модифицированным дуплексом поли(Г)ћполи(Ц)
Препарат Характеристики интерферона
в крови в мозгу
титр, ед/мл соотношение типов, % титр, ед/мл соотношение типов, %
$\alpha$ $\gamma$ $\alpha$ $\gamma$
Поли(Г)ћполи(Ц) 640-1000 91,0 9,0 30-60 70,0 30,0
[Поли(Г)ћ(цис-ДДП)]ћполи(Ц) (N1) 1500-2000 95,0 5,0 300-400 25,0 75,0

Ранее нами было обнаружено, что при модификации цис-ДДП полирибонуклеотидного дуплекса поли(А)ћполи(У) возрастает количество индуцированного интерферона в мозгу мышей [3]. Эффект для дуплекса поли(Г)ћполи(Ц) более выражен. Мы можем предположить, что усиление защиты от инфекции вирусом герпеса ЦНС может быть следствием того, что модификация платиновым лигандом дуплекса поли(Г)ћполи(Ц), в особенности на уровне нити поли(Г) (препарат N 1), усиливает проникновение индуктора или же (что менее вероятно) индуцированного интерферона в мозг животных. По-видимому, именно наличие связанной платины повышает мембранную специфичность дуплекса и облегчает его проникновение через гематоэнцефалический барьер. О повышении проницаемости этого барьера могут свидетельствовать результаты проведенных нами контрольных экспериментов. Мы вводили мышам внутривенно 0,5 мл 2% раствора красителя метиленового синего через 4 ч после интраназального введения дуплексов с последующим измерением оптической плотности в экстрактах легких и мозга забитых животных. Усредненные значения оптической плотности в объединенных экстрактах мозга 4 мышей составили: после введения изотонического раствора хлорида натрия (плацебо) - 0,048; немодифицированного дуплекса - 0,084; препарата N 1 - 0,382; препарата N 2 - 0,265. Таким образом, максимальное проникновение красителя в мозг наблюдалось именно после введения дуплекса, модифицированного на уровне нити поли(Г). Возможно, что стимуляция проникновения индуктора в мозг может быть следствием ограниченной деструкции дуплекса в участках, где произошло связывание цис-ДДП и имеются локальные дефекты структуры. Это может приводить к образованию более коротких, но достаточно регулярных фрагментов с большей трансмембранной проникающей способностью.

Полученные нами результаты, в особенности важный факт появления значительных количеств интерферона в мозгу животных и перераспределение типов интерферона в мозгу в пользу $\gamma$-интерферона, а также селективное повышениелибо противогриппозной [1], либо противогерпетической активности в зависимости от способа модификации поли(Г)ћполи(Ц), позволяют продолжить разработку стратегии синтеза семейства полинуклеотидных индукторов интерферона, представители которого могут применяться по выбору с учетом особенностей организма и типа вирусной инфекции.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N9, стр. 10-12.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксенов О.А., Мурина E.A., Коган Э.М. и др. Вопр вирусол 1995; 40: 56-59.

2. Аксенов О.А., Платонова Г.А., Тимковский А.Л. Заяв на пат РФ N 97106675/04б. Приор от 27.04.1997.

3. Аксенов О.А., Платонова Г.А., Тимковский А.Л. Антибиотики и химиотер 1999; 6: 12-15.

4. Тимковский А.Л., Аксенов О.А., Бреслер С.Е. и др. Вопр вирусол 1973; 18: 350-355.

5. Novokhatsky A.S., Ershov F.I., Timkovskii A.L. et al. Acta Virol 1975; 19: 121-129.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования