Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

L-Глутаматоксидаза стрептомицетов: применение в клинической и фундаментальной медицине

Виноградова К.А., Додзин М.Е.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

В начало...


L-Глутаматоксидаза - фермент, осуществляющий окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты, открыт сравнительно недавно [1]. Он обладает многими уникальными свойствами, среди которых важнейшим с точки зрения его практического использования является высокая специфичность действия. Перспективы практического применения этой новой оксидазы для детекции L-глутаминовой кислоты, а также ряда других соединений, были поняты и высоко оценены сразу же после открытия этого фермента [2]. С тех пор интерес к L-глутаматоксидазе постоянно поддерживается на высоком уровне, и число научно-методических разработок на ее основе в самые последние годы непрерывно возрастает. В подавляющем большинстве работ используется L-глутаматоксидаза, продуцируемая Streptomyces sp. Х-119-6 (Yamasa Shayu Co, Chiba, Japan). Она обладает высокой стабильностью, селективностью и рН-оптимумом действия, подходящим для анализа различных образцов [3, 4]. Ряд разработок основан на использовании ферментов, продуцируемых Streptomyces endus [5], Streptomyces sp. N14 [6], Streptomyces sp. P-26 [7], и Streptomyces platensis NTU 3304 [8].

1. Определение L-глутаминовой кислоты

Тот большой интерес, который возник к L-глутаматоксидазе почти сразу же после ее обнаружения в природных источниках, а также непрерывно расширяющиеся области ее практического использования, в первую очередь, определяются насущной потребностью в быстрой и точной детекции глутаминовой кислоты для нужд клинической и фундаментальной медицины, нейрофизиологии и нейропатологии, пищевой и фармацевтической промышленности, а также биотехнологии (при мониторинге различных биотехнологических процессов) и аналитической биохимии [9, 10, 11].

L-Глутаминовая кислота содержится в разнообразном биологическом материале, она входит в состав многих продуктов питания и фармацевтических средств. Она играет важную роль в жизнедеятельности человека. В последние годы получены новые данные о ее значении для функционирования центральной нервной системы и роли в развитии таких заболеваний, как инфаркты, инсульты и различные нейропатологические состояния [11, 12]. Использование L-глутаматоксидазы для разработки удобных и точных методов определения глутаминовой кислоты имеет значение для прогресса нейрофизиологических и нейрофармакологических исследований [13, 14].

Определение глутаминовой кислоты занимает важное место в аналитической биохимии (исследование гидролизатов белков, мониторинг реакции трансаминирования) и в клинической диагностической биохимии при диагностике болезней, связанных с резкими изменениями уровня глутаминовой кислоты в организме, в частности заболеваний печени и сердечно-сосудистой системы [9, 10]. В клинических лабораториях глутаминовую кислоту используют для определения активности некоторых аминотрансфераз.

Несмотря на то, что глутаминовая кислота не относится к существенным компонентам питания человека, она включена в состав многих пищевых продуктов и фармацевтических препаратов благодаря своей способности сенсибилизировать вкусовые рецепторы, а также стимулировать деятельность мозга [15, 16]. В одних продуктах (суповые кубики, сухие супы, различные мясные изделия, соусы, пасты, приправы, алкогольные и диетические напитки и др.) она является улучшающей вкус пищевой добавкой, в других (разные сорта чая) ее наличие и процентное содержание относится к важнейшим сортовым характеристикам, определяющим стоимость продукта [17]. Избыток глутамата в пище чувствительных к нему людей приводит к развитию "синдрома китайского ресторана", с симптомокомплексом головной или желудочной боли [10, 18].

В настоящее время потребность в глутаминовой кислоте постоянно возрастает (в том числе и для нужд пищевой и фармацевтической промышленности), увеличивается объем ее промышленного производства, что в свою очередь требует быстрых и удобных методов ее детекции для мониторинга и контроля процесса получения этого соединения.

Различные методы, предложенные ранее для определения глутаминовой кислоты (хроматографический, ферментно-спектрофотометрический и др.), включают длительные и сложные процедуры и не пригодны для быстрого анализа большого числа образцов или для мониторинга процесса в режиме реального времени [10, 11]. В настоящее время основное внимание сосредоточено на разработке и внедрении глутаматчувствительных биосенсорных систем, сочетающих выcoкую селективность детекции с относительной простотой использования и во многих случаях со значительным снижением стоимости анализов по сравнению с другими аналитическими методами. Ранее были сконструированы биосенсоры, чувствительные к L-глутаминовой кислоте, на основе клеток микроорганизмов, растительных тканей и ферментов (глутаматдекарбоксилазы, глутаматдегидрогеназы и глутаматсинтетазы) [11]. Введение в научный и практический обиход нового фермента - L-глутаматоксидазы представило новые возможности для разработки исключительно эффективных методик детекции глутаминовой кислоты. Оказалось, что в ряду глутаматчувствительных биосенсорных систем, основанных на ферментах - глутаматдекарбоксилазе, глутаматдегидрогеназе, глутаматсинтетазе и глутаматоксидазе - последние превосходят остальные по относительной простоте использования, высокой специфичности определения и стабильности работы.

Детектировать глутаминовую кислоту можно по любому участнику реакции ее окислительного дезаминирования: либо по убыли кислорода, либо по количеству образующихся NН3, $\alpha$-кетоглутаровой кислоты или Н2О2 [4]. Чаще всего детекцию проводят по образующемуся пероксиду водорода, реже - по убыли кислорода, используя для этого электрохимические устройства - Н2О2- или О2-селективные амперометрические электроды.

Если мембрана с иммобилизованным ферментом зафиксирована на электроде, то речь идет о ферментном электроде, а если она конструктивно отделена от электрода, то такая сенсорная система называется биореактором. Преимущества той или иной конструкции для определения глутаминовой кислоты подвергались специальному сравнительному изучению, и лучшие аналитические показатели были отмечены при работе с биореактором [19]. Использование амперометрических электродов (детекция H2O2 или O2) предпочтительнее, чем потенциометрических (детекция NН3), так как первые имеют более высокую чувствительность. Однако недостатком амперометрического определения является относительно высокий потенциал (500-900 мВ), при котором происходит детекция, что приводит к помехам определения из-за наличия других электроактивных веществ, часто присутствующих во многих анализируемых образцах (в сыворотке крови, моче, в культуральной жидкости и т.д.). Для снижения рабочего потенциала используют различные приемы - модифицирование поверхности электрода, применение различных медиаторов, биферментных электродов, комбинирование нескольких мембран с различной проницаемостью и др. [2, 6, 9, 10, 11, 16, 20-25]. При использовании кислородоселективных электродов к неточностям определения могут также привести колебания в концентрации кислорода в исследуемых образцах [11, 21]. В целом, при определении L-глутаминовой кислоты в условиях in vivo (например, в мозгу животных) предпочтительнее использовать мониторинг Н2О2, так как исходное содержание кислорода в тканях сильно варьирует, что затрудняет калибровку сенсора [8].

Основные рабочие характеристики биосенсоров на основе глутаматоксидазы даны в таблице. Необходимо, однако, отметить, что использование различных мембран для элиминирования "мешающих" веществ поднимает нижний уровень детекции, увеличивает время получения ответа и вызывает сдвиг области линейного ответа. Большое влияние на чувствительность сенсора оказывает вещество, используемое для иммобилизации фермента [8, 10, 11, 26].

Таблица. Основные рабочие характеристики глутаматчувствительных биосенсорных систем на основе L-глутаматоксидазы
Исследуемый образец Область линейного определения, мкМ Нижняя граница детекции, мкМ Время получения ответа Литературный источник
Cыворотка, приправы 1-1000 10 1 мин [36]
Приправы 5-1000 4 1 мин [19]
Мониторинг биосинтеза глутаминовой кислоты 120-840 120 менее 3 мин [8]
Продукты питания 200-2000   1 мин [16]
Буфер менее 200 10 1 мин [20]
Протеиновые таблетки, пищевые продукты 0,05-500 0,035 14 сек-2 мин [11]
Сыворотка крови 0,05-500 30-90 14 сек-2 мин [18]
Продукты питания 2,6-800 2,6 2 мин [9]
Буфер, культура клеток 100-1500 100   [21]
Kультура клеток млекопитающих менее 200   менее 1 мин [23]
Приправы, мониторинг биосинтеза глутаминовой кислоты 2000-20000   1 мин [7]
Буфер 0,1-100   1 мин [2]
Приправы 10-1000     [34]
Пищевые продукты 10-300   5 мин [30]
Пища, фармацевтическая продукция 10-500 5 15 сек [26]
Сыворотка крови 5000-50000     [31]
Продукты питания и фармацевтические препараты 20-1000   1,4 мин [15]
Плазма крови, моча 8-800 5 30 сек [10]

Помимо электрохимических методов детекции пероксида водорода используют и другие методы - спектрофотометрическое определение [4, 26], хемилюминесцентное определение с участием люминола и феррицианида калия и применением люминофотометра [27]. Потребление кислорода может быть также учтено кислородным волоконно-оптическим датчиком, фиксирующим изменения люминесценции специального слоя, чувствительного к концентрации О2 [15].

Очень часто биосенсорная система включает проточно-инжекторное устройство, обеспечивающее поступление образцов в систему и прохождение через нее тока исследуемой жидкости с заданной скоростью. Отмечено влияние скорости потока жидкости на чувствительность биосенсора [10]. Биосенсорная система с автоматическим проточно-инжекторным устройством может быть особенно полезна при мониторинге биопроцесса с целью динамической детекции глутаминовой кислоты в режиме реального времени [26, 28, 29]. Введение в систему специального устройства для переключения каналов, по которым следуют потоки исследуемых образцов, дает возможность в одной и той же операции последовательно определять количество глутаминовой кислоты в образце и в контроле (без фермента) [30]. Создана автоматическая многоканальная, с проточно-инжекторным устройством, биосенсорная система для определения нескольких компонентов среды (в том числе и глутамата) в динамике, при мониторинге биопроцесса получения пищевых продуктов. Система была снабжена компьютерной программой и опробована для получения пищевого продукта (соуса) в ферментере, показав хорошие рабочие характеристики и высокую пригодность для мониторинга биопроцесса в режиме реального времени [28].

Одно из важнейших направлений разработок- миниатюризация биосенсоров. Полупроводниковая технология позволила создать микроэлектроды для глутаматчувствительного биосенсора, используемого в клинических лабораториях [31].

Большинство биосенсоров, разработаных на основе глутаматоксидазы, изготовлены и используются в лабораторных условиях, демонстрируя там очень хорошие рабочие характеристики и большие возможности практического использования. При переходе к широкомасштабному применению на практике одной из важнейших рабочих характеристик сенсорной системы является длительность сохранения ее в активном рабочем состоянии. Использование модифицированного графитного электрода со стабилизирующими добавками дает возможность сконструировать глутаматчувствительный сенсор с длительным сроком хранения, что делает его приемлемым для коммерческого практического использования [32, 33].

К настоящему времени разработаны глутамат-чувствительные биосенсорные системы, адаптированные для определения глутамата в сыворотке крови и моче [10, 11, 17, 31], в продуктах питания и фармацевтических препаратах [9, 11, 15-17, 19, 26, 30, 34, 36], для его мониторинга в культурах клеток [21, 29, 35], для динамического контроля за ферментациями в пищевой индустрии [6, 28], а также в микродиализатах при выполнении нейрофизиологических исследований [12, 25, 37, 38].

Ввиду большого значения детекции L-глутаминовой кислоты для нейрофизиологии и нейропатологии и своеобразия биосенсорных систем для определения ее в центральной нервной системе, остановимся подробнее на этих научно-методических разработках.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования