Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Способность мицелия вариантов Streptomyces chrysomallus связывать экзогенный актиномицин D и синтез этими вариантами макротетролидов

Орлова Т.И., Булгакова В.Г., Грушина В.А., Полин А.Н.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

В начало...


Изучали динамику биосинтеза антибиотиков макротетролидов (МТЛ) в процессе роста на жидкой среде нескольких вариантов Streptomyсes chrysomallus - продуцента МТЛ и актиномицина C. Параллельно определяли способность мицелия этих культур (отмытого и суспендированного в физиологическом растворе) связывать экзогенный актиномицин D (АМД). На всем протяжении развития культур наблюдалась обратная корреляция между динамикой биосинтеза МТЛ и скоростью связывания АМД отмытым мицелием: активному биосинтезу МТЛ соответствовало снижение способности связывать АМД, снижению биосинтеза - увеличение способности связывать АМД. Предполагается, что процесс активного биосинтеза МТЛ коррелирует не только со снижением способности суспендированного мицелия связывать АМД, но и со снижением связывания актиномицина, синтезируемого и выделяемого в среду при культивировании S.chrysomallus. Снижение обратного поступления синтезированного антибиотика в клетку, по-видимому, является одним из компонентов системы устойчивости продуцента к собственному антибиотику.

Ключевые слова:

Streptomyсes chrysomallus, актиномицин D, макротетролиды.

Устойчивость микроорганизмов - продуцентов антибиотиков к собственному продукту обеспечивается разнообразными способами в зависимости от структуры и механизма действия антибиотика. Для каждого конкретного продуцента может существовать несколько путей, обеспечивающих его устойчивость к собственному антибиотику [1]. В частности, по данным [2], у продуцента актиномицина D (АМД) Streptomyces antibioticus установлены по крайней мере два фактора устойчивости к собственному антибиотику: присутствие в клетках продуцента актиномицинсвязывающего белка и уникальность природы транскрибирующего комплекса, образующегося между ДНК и РНК-полимеразой, позволяющая происходить транскрипции в присутствии актиномицина. Внутриклеточное содержание актиномицина снижается также благодаря выделению антибиотика в среду. Кроме того, для S.chrysomallus показано, что по мере развития культуры снижается способность мицелия к поглощению из среды экзогенного актиномицина [3]. Проведенное нами исследование связывания экзогенного АМД отмытым мицелием ряда вариантов продуцента актиномицина С (AMС) Streptomyсes chrysomallus также выявило снижение способности мицелия связывать антибиотик по мере развития культуры. Уровень поглощения АМД и возрастная динамика этого поглощения не зависели от способности или неспособности вариантов синтезировать актиномицин [4].

Известно, что все исследованные нами варианты S.chrysomallus синтезируют смесь макротетролидов (МТЛ) - антибиотиков-ионофоров [5], механизм действия которых связан с нарушением катионной проницаемости мембран и превращения энергии в мембранах [6]. На плотной среде варианты S.chrysomallus высокоустойчивы к МТЛ [5]. Ген устойчивости к МТЛ выделен из ДНК продуцента МТЛ Streptomyсes griseus, авторы полагают, что продукт гена может действовать как модификатор МТЛ [7].

В данной работе исследована возможная взаимосвязь между биосинтезом МТЛ вариантами S.chrysomallus и способностью мицелия этих культур связывать экзогенный АМД.

Материал и методы

В работе использовали следующие микроорганизмы: S.chrysomallus BKM 721 - варианты N 1 (не синтезирует актиномицинов, образует МТЛ) и N 3 (синтезирует АМС и МТЛ.); S.chrysomallus ВКМ 1332 вариант Н-2 (не синтезирует актиномицинов, образует МТЛ); Streptomyсes lividans ТС-64, не образующий антибиотиков. Условия культивирования микроорганизмов, приготовление отмытой суспензии мицелия описаны нами ранее [4]. Динамику роста культур определяли нефелометрически по изменению оптической плотности культуральной жидкости. Для определения оптической плотности культуральной жидкости и суспензий отмытого мицелия образцы разводили водой в 5 и 20 раз соответственно для непосредственного измерения (ФЭК-56М, светофильтр N6, толщина кюветы 1 см) и далее рассчитывали плотность исходной культуральной жидкости или суспензии.

Скорость связывания АМД суспензиями определяли спектрофотометрически по описанной ранее методике [4]. Исходная концентрация АМД в суспензии составляла 12 мкг/мл, расчетная оптическая плотность суспензии соответствовала 3,4 единицы, продолжительность инкубации мицелия с АМД- 10 мин, инкубацию проводили при комнатной температуре. Определение связывания АМД в присутствии МТЛ или грамицидина S проводили тем же методом, внося АМД после предварительной инкубации суспензии с антибиотиком в течение 10 мин. Уровень биосинтеза МТЛ повышали введением в 24-часовую культуру стрептомицета водного раствора пропионата натрия до конечной концентрации 0,15%. МТЛ в культуральной жидкости определяли по [8].

Препараты АМД, МТЛ и грамицидина S были получены в лаборатории антибиотиков Биологического факультета МГУ микробиологическим синтезом с использованием соответствующих продуцентов - Streptomyсes olivobrunneus, S.chrysomallus и Bacillus brevis var.G.-B.

Результаты и обсуждение

Исследовано соотношение между динамикой биосинтеза МТЛ изучаемыми стрептомицетами при росте на жидкой среде и скоростью связывания экзогенного АМД суспензиями этих культур. Изучено также влияние на связывание АМД экзогенного МТЛ.

Работа в основном проводилась с вариантами S.chrysomallus ВКМ 721 N l и S.chrysomallus ВКМ 1332 Н-2, синтезирующими только МТЛ. Это вызвано тем, что отмытый и суспендированный мицелий S.chrysomallus N 3, активно синтезирующий AMС (смесь, включающая актиномицины С1, C2 и C3, из которых С1 идентичен АМД), постепенно выделяет в среду инкубации некоторую часть внутриклеточного антибиотика, что искажает результаты определения скорости связывания АМД мицелием. Сохранение высокой устойчивости к актиномицинам вариантами N 1 и Н-2 [5] и близкие величины скоростей связывания АМД вариантами N1 и N 3 [4] позволили нам использовать в работе преимущественно варианты N 1 и Н-2.

Внесение в суспензию мицелия МТЛ (50 мкг/мл) практически не влияет на скорость связывания АМД клетками на всем протяжении развития исследованных культур. Видимо, экзогенный МТЛ не влияет на какие-либо компоненты системы устойчивости S.chrysomallus к внеклеточным актиномицинам, поскольку связывание является необходимым этапом поступления антибиотика в клетку. У чувствительного к МТЛ S.lividans (ингибирование роста при 5 мкг/мл МТЛ) также не обнаружено заметного влияния экзогенного МТЛ на поглощение АМД, т.е. даже у клеток с заведомо нарушаемыми МТЛ энергетическими характеристиками мембран этот антибиотик не оказывает воздействия на процесс связывания АМД из среды.

Использованный для сравнения мембранотропный антибиотик грамицидин S, вызывающий неспецифическое нарушение проницаемости мембран, в концентрации 10 мкг/мл значительно (до 50%) увеличивает скорость связывания АМД как всеми вариантами S.chrysomallus, так и S.lividans. При этом у активно синтезирующего АМС варианта N 3 в период интенсивного образования антибиотика, характеризующийся "разрыхлением" клеточных стенок мицелия [9], увеличение скорости связывания АМД в присутствии грамицидина S достигает 70-90%.

Ранее было показано [4], что суспензии мицелия вариантов S.chrysomallus, независимо от их способности синтезировать актиномицины, интенсивно связывают экзогенный АМД из среды инкубации, при этом 24-часовой мицелий (середина экспоненциальной фазы) осуществляет связывание с большей скоростью, чем 72-часовой мицелий (стационарная фаза). Параллельное определение синтеза МТЛ 24- и 72-часовой культурами и способности суспендированного мицелия связывать АМД показало, что наблюдается обратная корреляция между образованием МТЛ и поглощением АМД (рис. 1-4).

Рис.1. Биосинтез МТЛ культурами вариантов N1 и N3 S.сhrysomallus ВКМ 721 и связывание АМД суспензиями отмытого мицелия этих вариантов.
По оси абсцисс - возраст суспендированного мицелия, ч; по осям ординат: а - МТЛ, мкг/мл; б - скорость связывания АМД суспензией соответствующего мицелия, мкг/мл за 10 мин.
А - вариант N1; Б - вариант N 3. 1 - МТЛ; 2 - скорость связывания АМД.

Рис. 2. Динамика роста, биосинтеза МТЛ вариантом N1 S.chrysomallus BKМ 721 и связывание АМД суспензиями отмытого мицелия этого варианта.
По осям ординат: а - биомасса, оптическая плотность культуральной жидкости; б - МТЛ, мкг/мл; в - скорость связывания АМД суспензией мицелия, мкг/мл за 10 мин. А и Б - два типа динамики биосинтеза МТЛ. Здесь и на рис. 3 и 4 - 1 - биомасса, 2 - МТЛ, 3 - скорость связывания АМД.

Рис. 3. Динамика роста, биосинтеза МТЛ вариантом H-2 S.chrysomallus ВКМ 1332 и связывание АМД суспензиями отмытого мицелия этого варианта.
Условные обозначения - см. рис. 2.

Рис 4. Динамика роста , биосинтеза МТЛ вариантом H-2 S.chrysomallus BKМ 1332 при культивировании в присутствии 0,15% пропионата натрия и связывание АМД суспензиями отмытого мицелия, полученного в этих условиях.
Условные обозначения - см. рис. 2.

На рис. 1 приведены средние результаты нескольких опытов, в которых количество образовавшегося МТЛ и связывание АМД мицелием определяли только в 24- и 72-часовой культурах варианта N 1 (не образует актиномицинов) и N 3 (образует АМС). Во всех опытах к 72 ч роста происходил биосинтез заметных количеств МТЛ и наблюдалось снижение способности мицелия связывать АМД (всего проведено 8 опытов). Однако не всегда суспензии мицелия, полученные из культуры с более высоким уровнем накопления МТЛ, связывали АМД с меньшей скоростью, чем суспензии мицелия из культуры с более низким уровнем накопления МТЛ.

Более отчетливая корреляция этих двух параметров получена при анализе результатов серии опытов с вариантами N 1 и Н-2. Образование МТЛ и скорость связывания АМД определяли каждые 24 ч в течение 3-х суток (рис. 2-4). Процесс биосинтеза МТЛ штаммами S.chrysomallus достаточно нестабилен - при соблюдении стандартных условий культивирования динамика накопления и последующего снижения содержания МТЛ в культуре в значительной степени варьирует, что было использовано нами для определения изменения способности мицелия связывать АМД по ходу развития культур при различных вариантах динамики биосинтеза МТЛ.

Когда количество синтезируемого МТЛ плавно нарастало в течение 72 ч, происходило постепенное снижение способности мицелия связывать АМД (рис. 2А); приостановка или задержка процесса накопления МТЛ сопровождались практически прекращением снижения скорости связывания АМД (рис. 3А и 3Б), т.е. падение скорости связывания АМД, наблюдалось именно в периоды активного биосинтеза МТЛ.

Если в процессе роста культуры происходили заметные колебания интенсивности биосинтеза МТЛ, аналогичные колебания наблюдались и в отношении скорости связывания АМД мицелием (рис. 2Б), при этом максимум накопления МТЛ в культуре по времени совпадал с минимальным значением величины скорости связывания АМД.

Была исследована способность связывать АМД мицелием варианта Н-2, культивированного в присутствия фактора, влияющего на интенсивность и продолжительность биосинтеза МТЛ. Внесение в среду культивирования одного из предшественников биосинтеза МТЛ - пропионата натрия - стимулирует этот биосинтез вариантом Н-2 в 1,5-2 раза и удлиняет период биосинтеза до 168 ч (рис. 4). На кривой биосинтеза МТЛ наблюдались два максимума и один минимум, а на кривой, характеризующей скорость связывания АМД суспензией мицелия - два минимума и один максимум, при этом по времени максимумы первой кривой совпадали с минимумами второй, а минимум первой кривой - с максимумом второй. Таким образом, на протяжении всего периода культивирования микроорганизма сохранялась обратная корреляция между определяемыми параметрами. К 168 ч культивирования способность суспензии мицелия связывать АМД резко возросла, что обусловлено, видимо, началом вторичного роста и значительным увеличением в культуре доли молодого мицелия, активно поглощающего АМД. Максимумы и минимумы на кривой содержания МТЛ в культуре, возможно, соответствуют периодам преобладания процессов биосинтеза или гидролиза МТЛ в мицелии стрептомицета. Ранее Нефеловой с сотр. [10] было показано, что в мицелии S.chrysomallus var. macrotetrolidi в разные периоды развития культуры присутствуют МТЛ-синтаза и МТЛ-гидролаза.

Процессы биосинтеза культурами S.chrysomallus антибиотических веществ двух различных типов, видимо, должны быть связаны как на метаболическом, так и на генетическом уровне. Есть косвенные данные о генетической взаимосвязи биосинтеза актиномицинов и МТЛ: в хромосомной ДНК продуцентов актиномицинов Streptomyсes parvullus и S.antibioticus, не синтезирующих МТЛ, обнаружены последовательности, гомологичные последовательностям, кодирующим поликетид-синтазу, принимающую участие в биосинтезе поликетидных антибиотиков, в том числе МТЛ [11]. Более того, мутация, приводящая к потере биосинтеза актиномицина у S.parvullus, сопровождается появлением у культуры способности синтезировать МТЛ (цит. по [11]).

Обнаруживаемая корреляция между биосинтезом МТЛ культурами S.chrysomallus и способностью мицелия этих культур связывать экзогенный АМД, возможно, имеет определенное значение для проявления стрептомицетом устойчивости к собственному антибиотику - AMС, представляющему собой смесь трех актиномицинов - АМД (С1), С2 и С3. Образующие AMС варианты значительную часть синтезируемого антибиотика выделяют в среду культивирования. Обратному поступлению антибиотика в клетку препятствует увеличивающееся по мере развития культур снижение способности мицелия поглощать АМД (С1) и, вполне вероятно, другие компоненты актиномициновой смеси из среды, а также непрочное поверхностное связывание значительной части поглощенного из среды антибиотика [4].

Как поверхностное связывание актиномицинов мицелием, так и определяемое диффузией поступление этих антибиотиков в клетки [4] в большой степени определяются поверхностными свойствами клеточных стенок мицелия. Можно предположить, что процесс биосинтеза МТЛ сопровождается изменением поверхностных свойств клеток, влияющим на их способность связывать актиномицины из среды.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N10, стр. 8-12.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bibb M. The genetic manipulations of antibiotic production in Streptomyces. In: Manipulation secondare in culture. Robinson R., ed. Cambridge 1988.

2. Jones G. RNA synthesis in Streptomyces antibioticus: in vitro effects of actinomycin transcriptional inhibitors from 48 h. сells. Biochemistry 1976; 15: 3331-3341.

3. Marshall R., Redfield B., Katz E., Weissbach H. Changes in phenoxazinone synthetase activity during the growth cycle of Streptomyces antibioticus. Arch Biochem Biophуs 1968; 123: 317-323.

4. Орлова Т.И., Булгакова В.Г., Грушина В.А., Полин А.Н. Взаимодействие актиномицина D суспендированным мицелием стрептомицетов. Антибиотики и химиотер 1997; 42: 11: 3-11.

5. Коношенко Г.И., Авралева И.В., Анисова Л.Н., Орлова Т.И. Биологически активные вещества, образуемые рядом штаммов продуцента актиномицина С Streptomyces chrysomallus. Там же 1994; 39: 2-3: 22-25.

6. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб А.М. Мембрано-активные комплексоны. М 1974; 59-64: 412-416.

7. Platner R., Robinson J. A macrotetrolide resistance gene from S.griseus. International symposium on biology of асtinomycetes. Wisconsin 1991; P1-065.

8. Suzuki K., Nawata Y., Ando K. Tetranactin, a new miticidal antibiotic. V. Quantitative determination of macrotetrolide antibiotics. J Antibiot 1971; 24: 10: 675-679.

9. Орлова Т.И., Алехова Т.А., Шорникова М.B., Силаев А.Б. Некоторые особенности активного и неактивного вариантов Actinomyces sp. продуцента актиномицина С. Антибиотики 1981; 4: 246-252.

10. Нефелова М.В., Карелина И.Ю., Свердлова А.Н., Егоров Н.С. Выделение и свойства синтазы макротетролидов из мицелия актиномицета-продуцента. Биохимия 1989; 54: 11: 1873-1880.

11. Malpartida F., Hallam S., Kieser H. et al. Homology between Streptomyces genes coding for synthesis of different polyketides used to clone antibiotic biosynthetic genes. Nature 1987; 325: 6107: 818-821.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования