Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посмотрите новые поступления ... Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Гиполипидемическое действие аскофуранона в культуре клеток гепатобластомы G2

Тренин А.С.

НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН, Москва

В начало...


Изопреноидный антибиотик аскофуранон подавлял включение 14С-ацетата клетками Нер G2 в состав холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов, фосфолипидов и свободных жирных кислот. Подобное комплексное воздействие антибиотика на процессы синтеза и метаболизма липидов не связано с подавлением синтеза белка и токсичностью препарата.

Ключевые слова:

аскофуранон, гиполипидемическое действие, холестерин, липиды, культура клеток Нер G2.

Аскофуранон - изопреноидный антибиотик, впервые выделенный из фитопатогенного гриба Ascochyta viciae [1, 2]. Недавно в ходе поиска ингибиторов биосинтеза холестерина этот антибиотик был выделен из нового продуцента Paecilomyces variotii [3]. Для аскофуранона показано противовирусное, противоопухолевое и иммуномодулирующее действие [4, 5]. В экспериментах на животных продемонстрирован его гиполипидемический эффект [6, 7]. В опытах с использованием клеточных культур показано, что антибиотик влияет на липидный обмен [8, 9], способен активно подавлять синтез холестерина (ХС) [3, 8, 10]. В данной работе, выполненной с использованием культуры клеток Нер G2, представлены новые сведения о гиполипидемическом действии аскофуранона, его влиянии на процессы синтеза триглицеридов (Тгл), фосфолипидов (ФЛ), эфиров холестерина (ЭХ), образование свободных жирных кислот.

Материал и методы

Препарат аскофуранона получен в НИИНА РАМН [3, 10]. Его антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар в отношении различных тест-микроорганизмов: Bacillus subtilis АТСС 6633, Micrococcus luteus АТСС 9341, Staphylococcus aureus АТСС 21027, Escherichia coli АТСС 25922, а также в отношении грибов Candida albicans ИНА 3G, Aspergillus niger ИНА 12G и Fusarium oxysporum ИНА 204G.

Изучение действия микробных метаболитов на синтез холестерина, его эфиров и липидов различных классов проводили с использованием культуры клеток гепатобластомы G2 [11]. Клетки гепатомы Нер G2 культивировали в 75 см2 флаконах в минимальной среде Игла ("Flow", Великобритания) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл канамицина, 4 мМ L-глутамина при 37 њС в СО2-инкубаторе в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2. Последостижения монослоя клетки снимали с помощью раствора 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА и высевали в 24-луночные планшеты ("Flow", Великобритания) с плотностью 2x105 клеток на лунку.

Их дальнейшее культивирование проводили в планшетах до достижения клетками состояния субконфлуентного монослоя. Непосредственно перед экспериментом осуществляли кратковременную (1 ч) инкубацию в бессывороточной среде. В дальнейшем инкубацию клеток вели в среде Игла, содержащей 5 мкКи/мл натрия (214-С) уксуснокислого (удельная радиоактивность 40,6 Ки/моль).

Исследуемые препараты вносили в виде спиртовых растворов одновременно с радиоактивным предшественником из расчета 2,5 мкл на 0,5 мл среды. Контрольным препаратом служил ловастатин ("Merck Sharp and Dohme", CША). После инкубации в течение 3 ч в СО2-инкубаторе клетки дважды промывали холодным фосфатным буфером Дюльбекко следующего состава (в мМ): KCl - 2,68, КН2РО4 - 1,47, NaCl - 137,0, Na2HPO4x7H2O - 0,06, pH 7,0. Липиды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (3:2), после чего полученные растворы упаривали в атмосфере азота. Холестерин и липиды различных классов разделяли методом ТСХ на пластинах "Silufol" (ЧСФР) в системе: гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (75:20:1). Участки пластин, содержащие эфиры холестерина, холестерин, триглицериды, фосфолипиды и свободные жирные кислоты, вырезали и помещали в толуоловый сцинтиллятор (4 г 2,5-дифенилоксазола, 0,1 г 1,4-ди-2(5-фенилоксазолин)бензола, 1 л толуола) [12]. Измерение радиоактивности проводили на счетчике Rack Betta 2 ("LKB Wallac", Швеция). Включение 14С-ацетата в липиды разных классов представляли в пересчете на 1 мг клеточного белка, определяемого по Лоури [13].

Цитотоксичность антибиотиков определяли окрашиванием клеток НерG2 0,5% раствором трипанового синего ("Flow", Великобритания), а также изучая воздействие препаратов на синтез белка. В последнем случае клетки HepG2 инкубировали с препаратами антибиотиков в течение 3-х часов в присутствии 5 мкКи/мл 14С-лейцина (удельная радиоактивность 135 Ки/моль). После отмывания клеток от не включившегося радиоактивного предшественника 0,1 М холодным фосфатным буфером (рН 7,0) их лизировали, добавляя 0,1 н. NaOH. Клеточный белок осаждали с помощью 10% ТХУ, дважды промывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Измерение радиоактивности проводили в диоксановом сцинтилляторе ЖС-8.

Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. За 100% брали уровень включения радиоактивных предшественников в клетки контрольных лунок, содержащих 0,5% этанола. Полученные данные являются результатом трех измерений.

Результаты и обсуждение

Аскофуранон обладал антибиотической активностью в отношении грамположительных бактерий Bacillus subtillis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, грибов Aspergillus niger, и Fusarium oxysporum, был неактивен в отношении грибов Candida albicans и грамотрицательных бактерий, что соответствует ранее полученным результатам [1, 3].

В наших экспериментах аскофуранон оказывал выраженное воздействие на синтез липидов в культуре клеток гепатобластомы G2 (рисунок). Наиболее сильно препарат подавлял биосинтез ХС (ИК50 400 нг/мл или 1,0 мкМ). Аналогичным образом в его присутствии снижалось включение 14С-ацетата во фракцию ЭХ, активно подавлялся синтез Тгл (ИК50 900 нг/мл или 2,2 мкМ) и ФЛ (ИК50 1,2 мкг/мл или 2,5 мкМ), наблюдалось резкое уменьшение содержания в клетках свободных жирных кислот.

Воздействие аскофуранона на включение 14С-ацетата клетками Нер G2 в состав холестерина (1), эфиров холестерина (2), триглицеридов (3), фосфолипидов (4), свободных жирных кислот (5) и включение 14С-лейцина в общий белок (6).
По оси абсцисс: концентрация препарата (мкг/мл); по оси ординат: включение 14С-ацетата в липиды или включение 14С-лейцина в белок (в % от контроля).

По своей способности к подавлению синтеза ХС аскофуранон значительно уступал известному ингибитору биосинтеза ХС - ловастатину (ИК50 0,2 мкМ), проявившему несколько иное воздействие на клетки Нер G2. В присутствии ловастатина не происходило подавления синтеза Тгл и ФЛ, не снижалось содержание свободных жирных кислот. В отличие от аскофуранона ловастатин в меньшей степени подавлял включение 14С-ацетата во фракцию ЭХ (ИК50 1,5 мкМ).

Подавление синтеза ЭХ под воздействием ловастатина объясняется тем, что препарат резко уменьшает синтез ХС, являющегося основой для образования эфиров. В случае аскофуранона природа ингибирования синтеза ЭХ вероятно сложнее и возможно в немалой степени связана с уменьшением другого составляющего компонента в синтезе ЭХ - свободных жирных кислот, содержание которых в клетках, как видно из представленных данных, резко снижено.

Уменьшением содержания в клетке жирных кислот можно объяснить также наблюдаемое подавление синтеза ФЛ. В свою очередь наличие самих свободных жирных кислот во многом определяется, как известно, процессами синтеза Тгл. Наши данные свидетельствуют о том, что в присутствии аскофуранона синтез Тгл заметно подавлен.

Следует отметить, что наблюдаемое нами подавление синтеза ЭХ, ХС, Тгл и ФЛ под воздействием аскофуранона происходит в клетках, вполне сохраняющих свою жизнеспособность, что подтверждают эксперименты с витальными красителями, а также относительно небольшое ингибирование синтеза белка (см. рисунок, кривая 6). Таким образом, эффекты, наблюдаемые в культуре клеток Нер G2, ни в коей мере не связаны с токсическим действием препарата. Подавление синтеза Тгл и ФЛ, весьма выраженное уже при использовании низких концентраций аскофуранона, является, по-видимому, весьма характерной чертой механизма действия этого антибиотика. Вместе с тем наиболее сильно аскофуранон влияет на синтез ХС и ЭХ.

Полученные данные, свидетельствующие о комплексном воздействии аскофуранона на процессы синтеза и метаболизма липидов в клетке, коррелируют с результатами зарубежных исследователей, продемонстрировавших наличие гиполипидемической активности у этого антибиотика при испытании на животных, а также в экспериментах с клеточными культурами. Введение препаратов группы аскофуранона приводило к снижению уровня ХС, Тгл, ФЛ, свободных жирных кислот в сыворотке крови крыс [5, 7, 8]. В опытах с культурой макрофагов подтверждена также способность аскофуранона к ингибированию синтеза Тгл [9]. Вместе с тем влияние аскофуранона на липидный обмен, отмечавшееся в предыдущих исследованиях, проводимых с культурами клеток (первичная культура лейкоцитов мыши, L 5178Y лимфома), заметно уступало воздействию, наблюдаемому в наших экспериментах с культурой клеток Нер G2. В исследованиях, проведенных с клетками мышиной лимфомы L 5178Y, для достижения 30% ингибирования включения 14С-ацетата во фракции Тгл и свободных жирных кислот требовалось использование аскофуранона в концентрации, превышающей 6,3 мкг/мл. Полное подавление осуществлялось при инкубировании с антибиотиком в концентрации 25 мкг/мл. Указанное воздействие на синтез липидов происходило на фоне выраженного подавления синтеза белка, заметного цитостатического действия препарата и имело, по мнению авторов, вторичный характер. Кроме того, в предыдущих исследованиях, проводимых с клетками L 5178Y лимфомы, одновременно с подавлением синтеза Тгл было отмечено усиление включения 14С-ацетата в ХС [8, 9].

В наших экспериментах 50% подавление синтеза Тгл имело место уже в присутствии 2,2 мкМ аскофуранона (0,9 мкг/мл) и не сопровождалось ингибированием синтеза белка, которое наблюдалось только при более высокой концентрации препарата, и не мешало выявлению его основных гиполипидемических свойств (см. рисунок). Таким образом, отмеченные нами эффекты не были следствием обнаруженной ранее токсичности препарата [6, 8, 9]. Необходимо также подчеркнуть, что при общем сильном воздействии на синтез и метаболизм липидов в клетках Нер G2 наиболее выраженным оказалось подавление синтеза ХС.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N1, стр. 7-9.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sasaki Н., Okutomi Т., Hosokawa Т. et al. Ascofuranone, a new antibiotic from Ascochyta viciae. Tetr Lett 1972; 2541-2544.

2. Sasaki Н., Hosokawa Т., Sawada М., Ando К. Isolation and structure of ascofuranone and ascofuranol, antibiotics with hypolipidemic property. J Antibiot (Tokyo) 1973; 26: 11: 678-680.

3. Терехова Л.П., Тренин А.С., Озерская С.М. и др. Образование аскофуранона культурой гриба Рaecilomyces variotii Bainier. Микробиология 1997; 66: 5: 611-615.

4. Magae J., Hosokawa Т., Ando К. еt al. Antitumor protective property of an isoprenoid antibiotic ascofuranone. J Antibiot (Tokyo) 1982; 35: 11: 1547-1552.

5. Magae J., Suzuki S., Nagai K. et al. In vitro effects of an antitumor antibiotic, ascofuranone, on the murine immune system. Cancer Res 1986; 46: 1073-1078.

6. Sawada М., Hosokawa Т., Оkutami Т., Ando К. Hypolipidemic property of ascofuranone. J Antibiot (Tokyo) 1973; 26: 11: 681-686.

7. Hosokawa Т., Suzuki К., Okutami Т., Sawada М., Ando К. Effect of ascofuranone on serum lipids of rat fed a cholesterol rich diet. Jpn J Pharmacol 1975; 25: 35-39.

8. Magae J., Nagai К., Ando К. et al. Effects of an antitumor agent, ascofuranone, on the macromolecular synthesis of intact cells. J Antibiot (Tokyo) 1983; 36: 7: 892-899.

9. Magae J., Nagai К., Suzuki S. et al. Macrophage-specific effect on lipid metabolism by an antibiotic, ascofuranone. J Antibiot (Tokyo) 1987; 40: 2: 202-208.

10. Тренин А.С., Терехова Л.П., Толстых И.В. и др. Новый микробный продуцент антибиотика аскофуранона, обладающего гиполипидемическим действием. Липопротеиды и атеросклероз: Тез докл симп. Ст-Пб 1995; 110.

11. Craig W.Y., Cooper A.D. Effects of chylomicron remnants and $\beta$-VLDL on the class and composition of newly secreted lipoproteins by Hep G2 cells. J Lipid Res. 1988; 29: 299-308.

12. Kosykh V.A., Novikov D.K., Trakht I.N. et al. Effects of chylomicron remnants on cholesterol metabolism in cultured rabbit hepatocytes: very low density lipoprotein and bile acid production. Lipids 1991; 26: 10: 799-805.

13. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall N.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: 265.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования