Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Трансфекция маточного эпителия при осеменении крольчих трансформированными сперматозоидами. Модель интернализации ДНК в спермий

А.В. Кузнецов, С.А. Каурова*, И.В. Кузнецова

Государственный научный центр прикладной микробиологии, Оболенск; *Институт биофизики клетки РАН, Пущино

Проблемы репродукции, N6-1998, с.29-33

В начало...


Тепловой шок, сыворотка крови, семенная жидкость, хлороквин, азид натрия, глутаровый альдегид и гепарин в разной степени блокировали связывание экзогенной ДНК со спермиями. Напротив, диметилсульфоксид и бычий сывороточный альбумин способствовали проникновению посторонней ДНК в мужские гаметы. После трансформации спермиев репортерной плазмидой pRK3lacZ и искусственного осеменения крольчих в эндометрии матки с помощью гистохимического окрашивания Х-gal зарегистрирована активность бактериальной $\beta$-галактозидазы. Обсуждается возможный механизм инфицирования клеток женского репродуктивного тракта посторонними ДНК, проникшими со сперматозоидами.

Ключевые слова:

сперматозоид, репортерная ДНК, эндоцитоз, трансфекция, эндометрий.

Словарь

Эндоцитоз - процесс проникновения веществ через мембрану, в основе которого лежит способность клетки активно поглощать вещества из окружающей среды в виде маленьких пузырьков.

Экзоцитоз - процесс, обратный эндоцитозу. Интернализация (internal - внутренний) - попадание веществ внутрь клетки, обычно, при участии специфических рецепторов.

Пенетрация (penetration - проникать, проходить сквозь, входить, пронизывать) - проникновение крупных частиц (спермии, бактерии) в клетку с использованием специальных механизмов.

Трансфекция - процесс проникновения ДНК в клетку.

Трансформация спермиев - процесс включения в спермии чужеродной ДНК.

Репортерная плазмида - кольцевая ДНК, кодирующая гены, которые позволяют легко ее идентифицировать после трансфекции в результате экспрессии.

Экспрессия гена - процесс считывания генетической информации с ДНК и, обычно, образование закодированного белка.

Моноклональные антитела - антитела, полученные от одного клона продуцирующих их клеток и взаимодействующие с определенной частью поверхности антитела.

Нокаутированное животное - животное, у которого удален определенный ген.

Ранее были представлены данные по кинетике [1, 2] и топографии [3] связывания экзогенной ДНК эякулированными сперматозоидами кролика. Был разработан способ трансформации мужских гамет ДНК с применением диметилсульфоксида (ДМСО) и теплового шока [4, 5]. Показано, что трансформированные спермии при искусственном осеменении самок вносят рекомбинантные ДНК в яйцеклетки, и эти ДНК способны экспрессироваться [3, 4] и встраиваться в геном [6]. Отмечен ряд аномалий в развитии доимплантационных эмбрионов, вызванных посторонними ДНК, внесенными спермиями [7].

В настоящей работе описан феномен инфицирования спермиями клеток поверхностного цилиндрического эпителия матки экзогенной ДНК. Приводятся результаты экспериментов, направленных на понимание механизмов взаимодействия ДНК и сперматозоида. Предлагается модель захвата, сохранения и частичного выброса сперматозоидами посторонней ДНК, объясняющая их способность трансфецировать экзогенной ДНК удаленные клетки.

Материал и методы

Подготовка спермиев. Эякуляты получали от половозрелых кроликов, сперматозоиды отмывали от семенной жидкости и оценивали их подвижность под микроскопом; семенную жидкость получали как описано ранее [1, 4].

ДНК. В экспериментах использовали плазмиду pRK3lacZ [6, 8]. ДНК метили [$\alpha$-32P]dNTP при помощи реакции ник-трансляции [4]. Радиоактивную ДНК инкубировали при комнатной температуре с 106-108 спермиев в присутствии различных агентов: бычьего сывороточного альбумина (БСА) (15 мг/мл), ДМСО (3%), сыворотки крови кролика (50%) об/об), семенной жидкости кролика или человека (50% об/об), хлороквина (1 мг/мл), азида натрия (15 мМ), гепарина (1000 Ед/мл), глутарового альдегида (2,5%), либо прогревали спермии при 60њС в течение 5 мин. По истечении 30 мин инкубации реакцию останавливали стократным разбавлением, спермии отделяли центрифугированием и определяли радиоактивность высушенного осадка [4]. Радиоактивность связанной ДНК выражали в % по отношению к добавленной ДНК.

Трансформация сперматозоидов. ДНК в количестве 10 мкг в 50 мкл буфера ТЕ, содержащего 10 мМ трис-НСl (рН 8,0) и 1 мМ EDTA, добавляли к суспензии сперматозоидов кролика, 5ћ106 клеток в 500 мкл раствора Эрла. Инкубацию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Суспензию клеток после разведения раствором Эрла использовали для искусственного осеменения крольчих (500 мкл на одну самку). Контрольные эксперименты проводили без добавления ДНК.

Осеменение крольчих в фазе эструса осуществляли катетером, вводя в вагину 100-200 мкл суспензии спермиев. Через 12 дней животных забивали, препарировали матку и под микроскопом отделяли эндометрий.

Активность бактериальной $\beta$-галактозидазы в тканях выявляли с помощью Х-gal (400 мкг/мл) при 30њС в присутствии 150 мкг/мл хлороквина для ингибирования активности эндогенной $\beta$-галактозидазы [3].

Результаты

Блокировка интернализации ДНК в спермии хлороквином. Изучали влияние ингибитора эндоцитоза - хлороквина на процесс взаимодействия радиоактивной экзогенной ДНК и сперматозоидов. В опытах использовали также ДМСО, увеличивающий проницаемость клеточных мембран [9], для того, чтобы шунтировать заблокированный хлороквином гипотетический везикулярный транспорт меченой ДНК. Предварительная обработка спермиев кролика в течение 30 мин хлороквином в концентрации, в 50 раз превышающей минимальную ингибирующую концентрацию - 80 мкМ [10], уменьшала количество связанной радиоактивной ДНК до 4,7%. Дополнительное введение в систему 3% ДМСО снимало ингибирующий эффект хлороквина (табл. 1). Подобное явление не наблюдали в экспериментах с использованием азида натрия, разобщающего окислительное фосфорилирование. Инкубирование спермиев кролика с радиоактивной ДНК в присутствии 15 мМ NaN3 приводило в течение первых 30 мин к связыванию 10,4% радиоактивности, через 60 мин к поглощению 41,6% 32Р-ДНК, а через 120 мин - 45,1% метки. Получасовая инкубация таких сперматозоидов в присутствии 3% ДМСО не приводила к связыванию значительных количеств дополнительной радиоактивной ДНК.

Таблица 1. Ингибирование и шунт предполагаемого везикулярного транспорта ДНК в сперматозоиды кролика
  Без ДМСО имп/мин (%) С ДМСО имп/мин (%)
Без хлороквина 39 446(100) 39 716 (100,7)
С хлороквином 1849 (4,7) 47 727 (120,1)
Примечание. Достоверный интервал составляет 15% от абсолютных значений измеряемых величин.

Связывание ДНК сперматозоидами при различных условиях. Отмытые от семенной жидкости спермии кролика через 30 мин инкубирования связывали 65 5% радиоактивной ДНК (табл. 2). В присутствии сыворотки крови кролика эта величина составляла 30 3%. Прогрев спермиев в течение 5 мин при 60њС вызывал некроспермию, с клетками связывалось 28 3% ДНК. Добавление семенной жидкости кролика или человека до 50% (об/об) уменьшало количество связанной меченой ДНК соответственно до 17 2 и 16 2%. В присутствии 1 мг/мл хлороквина сперматозоиды сохраняли двигательную активность и связывали 14 2% ДНК. Напротив, 15 мМ азид натрия приводил к обездвиживанию спермиев и связыванию 10 2% горячей ДНК. В присутствии 2,5% глутарового альдегида спермии кролика теряли подвижность и связывали 5 1% ДНК. Когда в суспензию добавляли гепарин (1000 Ед/мл) связывалось 1 1% ДНК. В 3% ДМСО сперматозоиды связывали 78 4% ДНК, а в присутствии 15 мг/ мл БСА доля связанной ДНК составляла 97 2%.

Таблица 2. Влияние различных факторов на способность сперматозоидов кролика связывать чужеродную ДНК и на их подвижность
Фактор (инкубиpoвaниe 30 мин при комнатной температуре) Связанная ДНК, % Подвижность (+/-)
Kонтроль - отмытые спермии 65 5 +
БСА (15 мг/мл) 97 2 +
ДМСО (3%) 78 4 +
Сыворотка крови кролика (50% об/об) 30 3 +
Семенная жидкость кролика (50% об/об) 17 2 +
Семенная жидкость человека (50% об/об) 16 2 +
Хлороквин (1 мг/мл) 14 2 +
Гепарин (1000 Ед/мл) 1 1 +
Тепловой шок (60 њС, 5 мин) 28 3 -
Азид натрия (15 мМ) 10 2 -
Глутаровый альдегид (2,5%) 5 1 -

Выявление экспрессии гена RSVlacZ в эндометрии матки

Отпрепарированная на 12-й день беременности крольчих слизистая оболочка, выстилающая полость тела матки, была пронизана трубчатыми железами, которые открывались на поверхности эпителия (рис. 1). Поверхностный функциональный слой эндометрия контрольных самок, покрытых самцами, не окрашивался X-gal в присутствии ингибитора эукариотической $\beta$-галактозидазы - хлороквина (см. рис. 1,а). В случае искусственного осеменения крольчих сперматозоидами, трансформированными плазмидой pRK3lacZ, мы наблюдали яркое сине-зеленое окрашивание клеток поверхностного, толстого слоя эндометрия после гистохимического окрашивания X-gal (см. рис. 1,б), свидетельствующее об экспрессии бактериального гена lacZ.

Рис. 1. Фрагменты эндометрия матки кролика, окрашенные X-gal.

а - контроль (без ДНК), б - опыт (с ДНК pRK3lacZ). Светлая область - просвет железы эндометрия (х100).

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования