Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Иммуноферментный анализ FAS-рецептора (CD95) у лиц с патологией щитовидной железы

Н.В. Пивень1, В.В. Новиков2, Л.Н. Лухверчик3, Е.И. Кузьменкова4

1Институт биоорганической химии НАН Б,
2Нижегородский государственный университет им .Н.И.Лобачевского, Россия
3Международный экологический университет им.А.Д.Сахарова,
4Республиканский консультативный эндокринологический центр МЗ РБ, Минск, Беларусь

Иммунопатология, аллергология, инфектология N3-2001, с.15-20.

В начало...


С целью изучения патогенетической роли нарушений механизмов апоптоза при различных формах патологии щитовидной железы (ЩЖ) изучена концентрация растворимой формы Fas-рецептора (FasR,CD95) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) на основе моноклональных антител (МАТ) у лиц со скрытым и клинически выраженным гипотиреозом, а также у больных раком ЩЖ. Обнаружено повышение концентрации FasR при различных формах гипотиреоза и снижение у больных с онкопатологией ЩЖ. Сделан вывод о взаимосвязи характера патологического процесса и концентрации FasR в крови, которая может служить количественным маркером нарушений механизмов апоптоза при патологии ЩЖ.

Ключевые слова:

апоптоз, Fas-рецептор - CD95, щитовидная железа, гипотиреоз

В последние годы одной из актуальных проблем экспериментальной и клинической медицины является изучение патогенетической роли нарушений молекулярных механизмов апоптоза в развитии целого ряда заболеваний. Показано существование взаимосвязи между нарушениями регуляции процесса апоптоза и развитием онкологических, аутоиммунных и других заболеваний [1], сопровождаемое снижением эффективности иммунологического надзора. Исследования целого ряда авторов выявили новые механизмы подавления иммунологического надзора, связанные с апоптозом и Fas-антигеном-рецептором (FasR, APO-1, CD 95) [2].

FasR относится к рецепторным белкам семейства факторов некроза опухолей - ФНО. Он экспрессируется на поверхности многих типов клеток: тимоцитов, фибробластов, гепатоцитов, кератиноцитов, активированных Т- и В-лимфоцитов [3,4]. FasR у человека состоит из 335 аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам 1 типа. В его структуре выделяют внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены [5]. Примерно 80 аминокислотных остатков образуют домен клеточной смерти, который, участвуя в белок-белковом взаимодействии с цитоплазматическими белками, генерирует сигнал разрушения клетки [6]. Основная функция системы Fas-рецептор-Fas-лиганд (FasL) - индукция апоптоза в клетках [7]. При связывании лиганда с рецептором происходит олигомеризация цитоплазматических белков, в результате чего активируется апоптозоспецифическая протеаза (каспаза-8) и развиваются характерные для апоптоза процессы [8]. Таким образом, взаимодействие FasR с FasL (или моноклональными антителами к FasR) приводит к запуску апоптоза в клетке [9].

Менее изучена значимость растворимых сывороточных форм FasR, которые образуются либо за счет протеолитического расщепления мембранных форм (shedding - шеддинг), либо за счет альтернативного сплайсинга мРНК, приводящего к образованию транскрипта, соответствующего растворимой форме. Чаще всего это укороченный транскрипт, не содержащий участка, соответствующего трансмембранному региону [10]. Механизмы регулирующего действия растворимых форм FasR в организме могут быть различными и еще до конца не изучены. Первоначально считалось, что растворимые формы блокируют связывание мембранной формы FasR с Fas-лигандом за счет взаимодействия с FasL в кровотоке. Однако в настоящее время существуют сведения об участии растворимых форм FasR в защите FasL от деградации, передаче проапоптотического сигнала и запуске апоптоза. Сам факт сброса FasR с мембраны при протеолитическом шеддинге может приводить к модуляции иммунных реакций и возникновению различных эффектов, участвующих в патогенетических механизмах, с одной стороны, и вносящих свой вклад в нарушение гомеостаза - с другой [11].

Целью настоящей работы было изучить концентрацию растворимой формы Fas-рецептора методом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител (мАТ) и оценить ее клинико-диагностическую и патогенетическую роль при различных формах патологии ЩЖ (субклинический гипотиреоз, аутоиммунный тироидит, рак).

Материалы и методы.

Было обследовано 72 человека в возрасте от 18 до 40 лет: 32 человека - со скрытым доклиническим гипотиреозом, 20 - лица с клинически выраженным гипотиреозом (аутоиммунный тиреоидит), 9 - больные, прооперированные по поводу рака ЩЖ, контрольную группу составили здоровые лица (11 человек) того же возраста. У всех обследованных лиц методом радиоиммуноанализа предварительно был изучен тироидный статус путем оценки концентрации тироидных гормонов - тиротропного гормона (ТТГ), трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4) и белков - тироксинсвязывающего глобулина (ТСГ), тироглобулина (ТГ).

Концентрацию FasR (CD95) в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа на основе МАТ у этих же лиц по следующей схеме. Вначале стрипы сорбировали первыми МАТ к FasR, внося по 100 мкл в каждую лунку с последующей инкубацией в течение 18-20 часов при t 20-260С во влажной камере. После четырехкратной промывки фосфатно-солевым буферным раствором с добавлением твин-20, рН 7,0 0,5 (ФСР-Т) во все лунки вносили по 100 мкл 2% раствора пептона и вновь инкубировали во влажной камере при 20-260С в течение одного часа. После проведения четырехкратного промывания вносили в лунки контрольные и анализируемые образцы сывороток крови (100 мкл); для контроля конъюгата в 3 лунки вносили по 100 мкл раствора ФСР-Т. Проводили инкубацию в течение 18-20 часов при 20-260С, закрыв стрипы крышкой. Затем пробы промывали 6 раз и вносили по 100 мкл приготовленного непосредственно перед применением вторых МАТ против FasR, меченных пероксидазой хрена. Инкубировали во влажной камере в течение 1 часа с последующим промыванием (6 раз). Затем вносили по 100 мкл субстрата (перекись водорода) и ортофенилен диамина, растворенного в цитратном буфере (рН 5 0,5), и выдерживали пробы в течение 8-10 мин при 20-260С. После этого добавляли по 50 мкл 15%-ного раствора H2SO4 и немедленно проводили учет результатов анализа. Результаты оценивали на основании калибровочной кривой (рис. 1), отражающей зависимость оптической плотности от концентрации контрольного образца сыворотки с определенным содержанием FasR (принимая оптическую плотность разведения 1:2 за 1000 условных единиц).

Рисунок 1. Калибровочный график зависимости оптической плотности от концентрации Fas-R в калибровочных пробах

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ "BIOSTAT" и "EXEL".

Результаты и обсуждение

Проведенное нами комплексное клинико-лабораторное обследование позволило разделить всех обследованных лиц на 4 группы в соответствии с общепринятой классификацией [12,13]: здоровые лица, лица с доклиническим гипотиреозом, больные с клинически выраженной гипофункцией ЩЖ на фоне аутоиммунного тироидита (АИТ) и больные с различными формами рака ЩЖ (табл. 1).

Таблица 1. Тироидный статус обследованных лиц (M m)
Обследуемые группы Т3 общ. нмоль/л Т4 общ. нмоль/л ТТГ мМЕ/л ТСГ мг/л ТГ нг/мл
Здоровые лица (n=11) 2,12 0,09 109,2 6,8 1,31 0,19 23,1 1,5 24,6 2,4
Субклинический гипотиреоз (n=32) 2,1 0,16 129,97 9,5* 3,14 0,39* 24,2 1,35 6,54 0,7*
АИТ с клинически выраженным гипотиреозом (n=20) 1,78 0,15* 80,65 6,9* 20,15 2,3* 68,1 2,14 9,1 0,9*
Рак ЩЖ, (n=9) 2,48 0,61 134,19 13,8 3,66 0,97* 39,7 9,29 38,2 8,4
* - достоверность различий (p<0,05) по сравнению с контрольной группой.

Субклинический гипотиреоз характеризовался повышением уровня ТТГ на фоне нормального содержания Т4, Т3 и ТСГ, а клинически выраженный гипотиреоз - повышением уровня ТТГ и ТСГ, снижением уровня Т3 и Т4. Больные раком ЩЖ на момент обследования получали заместительную терапию тироксином (Т4) для коррекции послеоперационного гипотиреоза.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования