Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Зарегистрируйтесь на нашем сервере и Вы сможете писать комментарии к сообщениям Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Действие авермектинов на клетки лимфолейкоза Р-388 in vitro

Мосин В.А., Кругляк Е.Б., Стерлина Т.С., Корыстов Ю.Н., Шапошникова В.В., Кублик Л.Н., Левитман М.Х., Викторов А.В., Дриняев В.А.

Научно-биологический центр "Фармбиомед", Москва

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N6, стр. 16-20.

В начало...


(Окончание)

Детальное изучение влияния аверсектина С в широком диапазоне концентраций (0,01-10,0 мкг/мл) показало, что тенденция к снижению выживаемости наблюдается уже в дозе 0,03 мкг/мл (снижение до 96 6%); при концентрации 10,0 мкг/мл выживаемость составляет всего 7% (рис. 2). Ход кривой изменения доли поврежденных ядер в популяции противоположен изменению выживаемости. Основным типом повреждения ядер была их фрагментация (84%), оставшиеся 16% составлял пикнос. Эти повреждения ядер характерны для гибели по типу апоптоза. Кривая концентрационной зависимости имеет двухфазный характер: наблюдается снижение выживаемости до 50-60% при концентрации 0,3 мкг/мл, нерезко выраженное плато в интервале 0,3-3,0 мкг/ мл и последующее прогрессивное снижение выживаемости при увеличении концентрации. Можно предположить, что в популяции присутствуют две фракции клеток: чувствительная и резистентная к аверсектину С; выживаемость последней начинает существенно снижаться лишь при концентрациях аверсектина С свыше 3 мкг/мл.

Рис. 2. Выживаемость и повреждениея ядер клеток Р-388 под влиянием аверсектина С и авермектина А1.
По оси абсцисс - концентрация авермектинов (в мкг/мл); по оси ординат - выживаемость и доля поврежденных ядер (в %). 1 - аверсектин С, выживаемость; 2 - аверсектин С, повреждения ядер; 3 - авермектин А1, выживаемость. Длительность инкубации 22 часа; n = 3-6.

Чтобы определить возможную природу этих фракций клеток, следует иметь в виду, что прирост клеток Р-388 в контроле значительно варьирует. Обусловлено это вариабельностью исходного пролиферативного потенциала клеток, который зависит как от стадии роста клеток в брюшной полости мышей, так и от их индивидуальных особенностей. Оказалось, что эффект аверсектина С (снижение выживаемости) линейно возрастает с увеличением пролиферативного потенциала клеток (рис. 3). Это означает, что чувствительны к аверсектину С, главным образом, делящиеся клетки. По-видимому, их количество составляет примерно половину популяции в 7-суточной опухоли и первая фаза концентрационной кривой отражает действие аверсектина С на эту фракцию: наблюдается снижение выживаемости вдвое. В то же время покоящиеся клетки, резистентные к аверсектину С, обусловливают вторую фазу кривой.

Рис. 3. Зависимость действия аверсектина С на выживаемость клеток Р-388 от их пролиферативной активности.
По оси абсцисс - величина пролиферативной активности клеток в контроле (в %); по оси ординат - выживаемость клеток при добавлении аверсектина С (в %). Концентрация аверсектина С 0,3 мкг/мл; длительность инкубации 22 часа; n=5-15.

Снижение выживаемости может быть обусловлено как подавлением роста клеток, так и индукцией их гибели; при разных концентрациях естественно ожидать различные эффекты. Поскольку на клетках 7-суточной опухоли аверсектин С в малых концентрациях дает статистически недостоверный результат (рис. 2), эффект этих концентраций изучали на 4-суточных опухолях. Их исходный пролиферативный потенциал выше (доля клеток в фазе S составляет 37%, табл. 2) и, основываясь на только что изложенной зависимости, мы предполагали большую чувствительность таких клеток и более выраженный эффект.

Таблица 2. Распределение клеток лимфолейкоза Р-388 по содержанию ДНК в контроле и после 22-часовой инкубации с аверсектином С.
Условия опытов Число опытов (n) Доля клеток, %
sub G1 G1 S G2, M
4-суточная опухоль мышей
Kонтроль 3 16 2 34 3 37 4 13 3
Аверсектин С, 0,03 мкг/мл 3 17 4 47 5 27 3 9 2
7-суточная опухоль мышей
Kонтроль 9 11 3 68 3 18 2 9 1
Аверсектин С, 0,03 мкг/мл 4 45 6 41 6 10 4 4 1

Обнаружено, что аверсектин С оказывает оба вышеупомянутых эффекта. В малых концентрациях - 0,03 мкг/мл - аверсектин С только замедляет продвижение клеток по митотическому циклу, снижая вероятность перехода G1 -> S, что проявляется увеличением клеток в фазе G1 и снижением в фазах S и G2, М (табл. 2). При увеличении концентрации до 0,3 мкг/мл число клеток в фазах S и G2,М также снижается, т.е. также наблюдается блок перехода G1 -> S. Однако одновременно увеличивается число клеток с субдиплоидным набором ДНК (sub G1), что свидетельствует о деградации ДНК и гибели клеток. Из данных рис.1 и табл. 2 видно, что этот процесс при использованной концентрации аверсектина С существен. Деградация ДНК происходит по межнуклеосомному типу: в электрофореграммах ДНК, полученной из опытных (обработанных аверсектином С) клеток, отчетливо заметны полосы, соответствующие ее фрагментам (рис.4).

Рис. 4. Электрофореграммы ДНК, полученной из контрольных (1) и обработанных аверсектином С (2) клеток лимфолейкоза Р-388.
Концентрация аверсектина С 1,0 мкг/мл; длительность инкубации 22 часа.

Таким образом, гибель клеток Р-388 под действием аверсектина С происходит по типу апоптоза, так как характеризуется всеми его признаками: конденсацией хроматина, фрагментацией ядра и деградацией ДНК по межнуклеосомному типу.

Из всех авермектинов, входящих в состав аверсектина С, сильнее всего снижает выживаемость клеток авермектин А1, а при концентрациях, меньших 1,0 мкг/мл (0,3 мкг/мл), такой активностью обладает только он один (табл. 1). Поэтому только для авермектина А1 была определена концентрационная зависимость эффекта. Ее характер оказался таким же, как для аверсектина С, но эффект авермектина А1 проявляется при меньших (примерно в 4 раза) концентрациях, а по величине на уровне плато оба эффекта почти одинаковы (рис. 2). Для авермектина А1 эффект постоянен в интервале 0,03-1,0 мкг/мл, а при действии аверсектина С плато выражено не столь явно: с увеличением концентрации от 0,1 до 1,0 мкг/мл выживаемость продолжает постепенно снижаться. Это снижение, по-видимому, обусловлено действием других компонентов аверсектина С, поскольку аверсектин А2, не проявлявший активности при концентрации 0,3 мкг/мл, при увеличении концентрации до 1,0 мкг/мл снижает выживаемость клеток на 16 5% (табл. 1). Таким образом, действие аверсектина С на клетки Р-388 в концентрациях, меньших 0,3 мкг/мл, обусловлено авермектином А1, а в больших концентрациях дополняется авермектином А2. Следует только учесть, что авермектин А2 (1,0 мкг/мл) достоверно не увеличивает доли поврежденных ядер клеток Р-388: после 22 часов инкубации она равна 18 4% против 16 1% в контроле, т.е. эффект авермектина А2 цитостатический.

При концентрации 1,0 мкг/мл ивермектин снижает выживаемость клеток лимфолейкоза на 12 4%, что согласуется с данными литературы о его способности в концентрации 3 мкг/мл подавлять рост лейкемических клеток [ 12 ]. Однако в наших экспериментах действие ивермектина на выживаемость клеток Р-388 по величине самое слабое (из статистически достоверных), оно ниже, чем даже у авермектина А2 (табл. 1) и так же, как у последнего, только цитостатическое: доля поврежденных ядер при 22-часовой инкубации клеток в присутствии 1,0 мкг/мл ивермектина равна 16 3% против 16 1% в контроле.

Как следует из представленных результатов, индивидуальные авермектины группы А способны подавлять рост (А1, А2) и вызывать гибель (А1) клеток лимфолейкоза Р-388 in vitro. Антипаразитарная активность этих авермектинов низкая, но авермектин В1, наиболее эффективный антипаразитарный агент, в условиях наших экспериментов никакого влияния на клетки Р-388 на оказывал. Логично допустить, что преобладание того или другого типа активности определяется химическим строением авермектинов: группа А отличается от группы В наличием радикала СН3 в положении 5 [1], а относительно активный (по противоопухолевому действию) ивермектин от неактивного авермектина В1 - двумя водородными атомами в положениях 22,23 [3].

На основании полученных данных мы можем предположить, что противоопухолевый эффект аверсектина С определяется содержанием в нем примерно 30% авермектинов группы А; причем количество авермектина А1, самого активного в этом отношении компонента, составляет около 10-12% [6]. Способность аверсектина С тормозить рост и вызывать гибель клеток лимфолейкоза Р-388 в малых концентрациях (до 1,0 мкг/мл), вероятно, обусловлена авермектином А1, тогда как при увеличении концентрации препарата этот эффект дополняется цитостатическим действием авермектина А2.

Заключение

Таким образом, мы представляем новый класс соединений, обладающих следующим избирательным действием на культуру клеток лимфоидного происхождения:

- они не подавляют жизнедеятельности нетрансформированных тимоцитов [6];

- они ингибируют апоптоз тимоцитов, индуцированный ионизирующим облучением или обработкой дексаметазоном [6];

- они вызывают избирательную гибель опухолевых клеток лимфоидного происхождения путем апоптоза.

Очевидно, что противоопухолевая активность природного комплекса авермектина и некоторых его компонентов, впервые продемонстрированная в настоящей работе, представляет чрезвычайный интерес с точки зрения разработки новых лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N6, стр. 16-20.

ЛИТЕРАТУРА

1. Burg R.W., Miller B.M., Baker E.E. et al. Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob Agents Chemother 1979; 15:3:361-367.

2. Ostlind S.C., Long R. Insecticidal activity of the antiparasitic avermectins. Vet Rec 1979; 105:8:168.

3. Ivermectin and Abamectin. Campbell W.C. (ed.). New York: Springer-Verlag 1989; 363.

4. Рославцева С.А. Новая группа инсектоакарицидов и нематоцидов. Агрохимия 1987; 7:130-134.

5. Putter I., MacConnel J.D., Preiser F.A. et al. Avermectins: novel insecticides, acaricides and nematocides from a soil microorganism. Experientia 1981; 37:963-964.

6. Дриняев В.А., Кругляк Е.Б., Мосин В.А. и др. Аверсектин С: физико-химические и биологические свойства. Приклад биохим микробиол 1999; 35:2:206-212.

7. Дриняев В.А., Мосин В.А., Кругляк Е.Б. и др. Влияние даутина, ивомека и аверсекта-2 на тимоциты in vitro. Ветеринария 1998; 12:27-30.

8. Milner A.E., Wang H., Gregory C.D. Analysis of apoptosis by flow cytometry. In: Flow cytometry applications in cell culture. M.Al-Rubeai, A.N.Emery (eds.). New-York: 1996; 193-209.

9. Dean P.N., Jeft J.H. Mathematical analysis of DNA distribution derived from flow microfluorometry. J Cell Biol 1974; 60: 523-527.

10. Alles A., Alley K., Barret J.C. et al. Apoptosis: a general comment. FASEB J 1991; 5: 2127-2128.

11. Maniatis T., Fritsch E., Sambroock J. Molecular cloning a laboratory mammal. New-York 1982.

12. Didier A., Loor F. The abamectin derivative ivermectin is a potent P-glycoprotein inhibitor. Anticancer Drugs 1996; 7: 745-751.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования