Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Лабораторная и функциональная диагностика | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Научные статьиТрансфекция маточного эпителия при осеменении крольчих трансформированными сперматозоидами. Модель интернализации ДНК в спермий: Литература

Негативное действие экзогенной ДНК на оплодотворение и ранний эмбриогенез кролика в опытах по опосредованному сперматозоидами переносу генов

И.Ю. Щит, А.В. Кузнецов, С.А. Каурова, И.В. Кузнецова, В.В. Гусев

Государственный научный центр прикладной микробиологии, Оболенск; Институт биофизики клетки РАН, Пущино, Московская область

В начало...


ДНК из разных источников оказывала негативное действие на подвижность сперматозоидов кролика, оплодотворение и раннее развитие эмбрионов. В результате искусственного осеменения спермиями, трансформированными обработанной ультразвуком ДНК (0,5 мг/мл), количество неоплодотворенных яйцеклеток увеличивалось с 35,6 до 85,6%. При использовании рекомбинантных плазмид рRK3lacZ и pCMVlacZ отмечены задержки развития, фрагментация и гибель доимплантационных эмбрионов; количество аномальных зародышей составило соответственно 56,0 и 79,6%.

Ключевые слова:

ДНК, эмбриогенез, сперматозоиды.

Негативной стороной трансгенеза является повышенная эмбриональная и постнатальная смертность, а также пониженная жизнеспособность животных [1]. Часть особей бывают стерильными. Введение чужеродной ДНК может приводить к хромосомным аберрациям. Так, у трансгенных мышей описаны хромосомные делеции и дупликации [2], а у трансгенного кролика в лимфоцитах крови был обнаружен клон с добавочной хромосомой - мелким субметацентриком [3]. Сообщалось, что в экспериментах на Danio rerio после микроинъекции рекомбинантных конструкций выявлены общие и специфические типы нарушений эмбрионального развития, вызванные активностью введенной ДНК в зародышевых клетках. При использовании ДНК рmMT1-bGH и pRSV-bGH обнаружена дозовая зависимость в появлении аномалий эмбрионального развития. Отмечено, что число уродств возрастало при использовании RSV-промотора по сравнению с использованием mMT1 [4]. В опытах по переносу полной последовательности ДНК вируса саркомы Рауса (RSV) с помощью сперматозоидов в ооциты Xenopus laevis до 30% 7-дневных зародышей лягушки демонстрировали индуцированные пороки развития (дефекты глаз и головы, отеки, осевые деформации и т.д.). С помощью иммунохимического анализа срезов тканей дефектных животных удалось выявить структурные изменения, дезинтеграцию актиновых филаментов и увеличение экспрессии белка рр60src в миобластах и клетках мезенхимы [5]. Возникает вопрос: существуют ли механизмы защиты от проникновения экзогенной ДНК в геном при оплодотворении? Ранее было отмечено присутствие слабой нуклеазной активности в семенной жидкости хряка [6] и кролика [7]. Помимо этого охарактеризован белковый фактор IF-1 [8], препятствующий связыванию экзогенной ДНК со спермиями. В экспериментах по переносу чужеродных генов сперматозоидами кролика мы столкнулись с частой дегенерацией доимплантационных эмбрионов. Было резонным исследовать последствия воздействия чужеродных ДНК (чДНК) на сперматозоиды и доимплантационные эмбрионы кролика, полученные после искусственного осеменения трансформированными спермиями.

Материалы и методы

В опытах использовали кроликов породы советская шиншилла. Сперму брали от самцов-доноров при помощи искусственной вагины. Клетки отмывали от семенной жидкости в растворе Эрла или среде Хенкса. Активные спермии отделяли от неподвижных методом флотации. Конечная концентрация мужских гамет в суспензии составляла 107 в 1 мл [9, 10].

Сперматозоиды кролика инкубировали в среде Хенкса при комнатной температуре в течение 5, 15 и 30 мин в присутствии возрастающих концентраций бычьего сывороточного альбумина (БСА) - от 50 нг/мл до 5 мг/мл, гепарина - от 0,01 до 1000 Ед/мл или ДНК из спермы лосося - от 50 нг/мл до 5 мг/мл, которую в ряде случаев обрабатывали ультразвуком (озДНК). Регистрировали подвижность спермиев и оценивали ее в условных единицах (усл. ед.).

Трансформацию сперматозоидов ДНК осуществляли по ранее описанной методике [7, 11]. Применяли озДНК из спермы лосося в концентрации 0,5 мг/мл, либо линейные и/или кольцевые формы плазмид рRК3lасZ (предоставлена А.Б. Жадановым) и рСМVlасZ (получена от П.М. Чу-макова) в концентрации 5-10 мкг/мл.

Суперовулированных крольчих осеменяли суспензией трансформированных спермиев. Через 48 ч после осеменения из яйцеводов вымывали доимплантационные эмбрионы. Детекцию экспрессии экзогенной ДНК в ранних зародышах проводили с помощью методики окрашивания Х-gal [12].

Жизнеспособность эмбрионов определяли по степени развития морулы, морфологическому состоянию их клеточного комплекса и соответствию стадии развития зародыша возрасту от момента осеменения крольчихи-донора до извлечения змбриона.

Результаты

Уменьшение подвижности сперматозоидов в присутствии посторонней ДНК. При изучении влияния разных концентраций ДНК из спермы лосося на мужские гаметы кролика было отмечено, что инкубация сперматозоидов в течение 5, 15 или 30 мин с высокими концентрациями ДНК (0,5 и 5 мг/мл) вызывает значительное уменьшение подвижности клеток по сравнению со спермиями, на которые действовали низкими (от 50 нг/мл до 50 мкг/мл) концентрациями ДНК. Физическая причина уменьшения двигательной активности сперматозоидов из-за увеличения вязкости раствора с возрастанием концентрации ДНК исключается, так как аналогичный эффект давал обработанный ультразвуком полимер ДНК с длиной фрагментов менее 1000 пар нуклеотидов (рис. 1). Следовательно, влияние ДНК на активность мужских гамет имеет химическую природу. Добавим, что в аналогичных экспериментах БСА в концентрации до 5 мг/мл включительно не оказывал на подвижность спермиев никакого влияния; в противоположность этому гепарин в концентрации 1000 Ед/мл вызывал резкое снижение двигательной активности сперматозоидов, вплоть до их остановки.

Рис. 1. Влияние озДНК на подвижность сперматозоидов кролика.

Блокировка оплодотворения экзогенной ДНК. Далее изучали влияние на оплодотворение предварительной обработки спермиев кролика озДНК из спермы лосося, концентрация которой составляла 0,5 мг/мл (см. табл. 1). После осеменения спермиями, импрегнированными озДНК, в опыте получили 181 эмбрион, из которых 155 (85,6%) оказались не оплодотворены (отсутствовало второе полярное тельце). В экспериментах без использования ДНК количество неоплодотворенных яйцеклеток составило 35,6%. Было отмечено, что 64,4% контрольных и 14,3% опытных зародышей развились нормально. И в опыте и в контроле стадия развития эмбрионов 8-16 бластомеров соответствовала возрасту вымытых зародышей - 48 ч. В обеих группах отставание в дроблении, которое в большинстве случаев свидетельствует о начале дегенерации эмбриона, не наблюдали. У нормально дробившихся контрольных и опытных зародышей не было видимых морфологических отклонений. Отмечено равномерное развитие и симметричное расположение бластомеров. Перивителлиновое пространство было прозрачным, деформаций и повреждений zona pellucida не зарегистрировано. В опыте замечен 1 дегенерировавший эмбрион с полным разрушением бластомеров.

Таблица 1. Результаты оплодотворения после обработки спермиев кролика 0,5 мг/мл озДНК
  Опыт (с ДНK) Kонтроль (без ДНK)
Общее количество эмбрионов 181 (100%) 59 (100%)
Неоплодотворенные яйцеклетки 155 (85,6%) 21 (35,6%)
Дегенерировавшие зародыши 1 (0,1%) 0
Нормальный ритм дробления 26 (14,3%) 38 (64,4%)

Появление аномальных эмбрионов после оплодотворения трансформированными спермиями.

Исследовали морфологию окрашенных Х-gal эмбрионов, которых получили после осеменения крольчих спермиями, обработанными плазмидой рRК3lасZ. Выделен ряд нарушений развития доимплантационных эмбрионов кролика, связанных с остановками в развитии и фрагментацией отдельных бластомеров (рис. 2). Определенная доля яйцеклеток оставалась неоплодотворенной. Остановки развития наблюдали на разных стадиях деления зародышей; значительная часть зигот останавливалась на 1-клеточной стадии. Были обнаружены 2-клеточные зародыши с фрагментацией одного из бластомеров. Идентифицированы 4- и 8-клеточные зародыши с частичным разрушением бластомеров. Также найдены неравномерно развивающиеся эмбрионы (3- и 5-клеточные) с фрагментацией отдельных бластомеров. Выявлены зародыши с полным разрушением эмбриональных тканей (полная фрагментация). У некоторых эмбрионов наблюдали дефекты zona pellucida и помутнение перивителлинового пространства. В редких случаях у зародышей можно было отметить отделение бластомеров и полную потерю прозрачной оболочки. Нельзя утверждать, что причиной этих аномалий является экспрессия гена lасZ, так как подобные морфологические нарушения, но без окрашивания, встречались и у контрольных зародышей.

Рис. 2. Фрагментация ранних эмбрионов кролика после оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами, обработанными плазмидой pRK3lacZ.

Итоги опытов с плазмидами рRК3lасZ и pСМVlасZ. В серии экспериментов с рекомбинантными генетическими конструкциями было исследовано 284 доимплантационных эмбриона кролика, полученных в результате осеменения самок сперматозоидами, трансформированными плазмидой рRК3lасZ, и 98 зародышей после трансформации ДНК рСМVlасZ. В результате обработки эмбрионов хромогенным субстратом $\beta$-галактозидазы - Х-gal в первом случае зарегистрирован 131 (46,1%) окрашенный зародыш, а во втором - 39 (39,8%). При этом, когда использовали плазмиду рRК3lасZ, нормальный ритм дробления демонстрировали 125 (44%) эмбрионов, а в случае рСМVlасZ - 20 (20,4%). В обоих случаях отмечены значительные задержки в развитии эмбрионов (от одноклеточного до морулы) и примеры дегенерации зародышей (с частичным или полным разрушением эмбриональных тканей). У некоторых эмбрионов наблюдали дефекты или полную потерю блестящей оболочки, помутнение перивителлинового пространства, отделение и нарушение симметрии расположения бластомеров. Таким образом, при использовании ДНК рСМVlасZ количество аномалий составляло 79,6% и было больше, чем в случае применения плазмиды рRК3lасZ (56%). Кроме того, при работе с ДНК рRК3lасZ обнаружено, что 36,4% нормально дробящихся эмбрионов на стадии морулы окрашиваются Х-gаl, а среди зародышей с задержкой в развитии доля окрашенных эмбрионов составила 58,9%.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования