Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Научные статьиВлияние верапамиловой мази на морфологию волосяных фолликулов кожи морских свинок: эпидермис, клетки волосяных фолликулов, верапамиловая мазь.

Влияние блокаторов кальциевых каналов на клетки волосяного фолликула в культуре

Ю.К. Скрипкин, М.А. Чирченко, А.В. Васильев, В.А. Самсонов, А.В. Резайкина, В.В. Теркин

Центральный кожно-венерологический институт Минздрава РФ; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

В начало...


В условиях культивирования клеток из волосяного фолликула открывается возможность создавать комбинации трех различных субпопуляций клеток, определяющих функционирование волоса. Эта система была использована для изучения влияния блокаторов кальциевых каналов на пролиферативные характеристики клеток волосяного фолликула. Блокаторы кальциевых каналов привлекли внимание в качестве перспективных дерматологических лекарственных средств, способных селективно ингибировать пролиферацию эпидермальных кератиноцитов.

Ключевые слова:

волосяной фолликул, блокаторы кальциевых каналов.

Факторы, регулирующие рост и развитие волосяных фолликулов, до конца не известны. Однако их выявление представляет значительный фундаментальный и практический интерес. Наиболее перспективными агентами, определяющими деление клеток волосяного фолликула и контролирующими цикл роста волос, в настоящее время считаются факторы роста, стероидные гормоны, регуляторы ионных токов, медиаторы дермально-эпидермальных взаимодействий и иммунной системы. Изучение регуляции роста волос сдерживалось, в основном, отсутствием адекватных и удобных моделей, прежде всего in vitro [1].

Разработка методов эффективного выращивания эпидермальных кератиноцитов позволила создать модели культивирования волосяных фолликулов как органоидов in vitro.

Информативными оказались способы культивирования волосяных фолликулов на поверхности субстрата и в коллагеновом геле, позволяющем сохранить трехмерную структуру волосяного фолликула [2].

Выделенные эпидермальные фолликулы человека, будучи помещены на пластиковый субстрат культурального сосуда, прикреплялись и давали начало культуре, идентичной межфолликулярным клеткам с сохранением характерной эпидермальной морфологии.

В обеих модельных системах сохранялась морфология фолликула, наблюдался синтез характерных кератинов и удлинение волосяного стержня. Скорость роста волосяного фолликула in vitro устанавливается примерно через 4 дня и составляет 0,3 мм в день, что примерно соответствует скорости роста, наблюдаемой in vivo [1]. Однако удлинение стержня волоса не единственный параметр, по которому возможно проводить оценку влияния различных агентов на волосяные фолликулы in vitro. Культура волосяных фолликулов позволяет оценивать интенсивность синтеза ДНК и белка, что является объективным показателем состояния фолликула. Именно по этим показателям, дополняющим данные по увеличению длины фолликула, была проведена исчерпывающая оценка действия факторов роста и интерлейкинов на органную культуру волос [3].

Не менее удобными и информативными оказались модели с использованием культивируемых клеток, растущих из волосяных фолликулов. Использование различных популяций, различающихся по пролиферативным, биохимическим и морфологическим показателям, и их комбинаций позволяет точнее определять механизмы и мишени действия изучаемых агентов и факторов [4].

Нами была освоена технология выделения волосяных фолликулов, культивирования их составляющих клеток для оценки механизмов влияния блокаторов кальциевых каналов на рост волос.

Материал и методы

Выделение волосяных фолликулов проводили по модифицированной нами методике выделения эпидермальных кератиноцитов [6].

С этой целью, взятые у здоровых доноров биоптаты кожи висков без подкожной жировой клетчатки в стерильных условиях разрезали на фрагменты размером 5 - 10 мм и помещали в 0,25% раствор трипсина. После инкубации при 4њC в течение 16 - 18 ч фрагменты переносили в раствор Хенкса и эпидермис отделяли от дермы. Выделенные фрагменты эпидермиса содержали значительное число волосяных фолликулов. Волосяные фолликулы извлекали из трипсинизированных лоскутов эпидермиса при помощи пинцета и затем инкубировали в смеси сред DMEM -F12 (1:1) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, эпидермальным фактором роста (10 нг/мл), инсулином (5 мкг/мл), изопротеринолом (10-6М). В качестве субстрата для прикрепления волосяных фолликулов использовали пластик с сорбированным на нем коллагеном I типа. Для этого раствор коллагена, выделенный из хвостов крыс уксуснокислой экстракцией, вносили в культуральный сосуд (Nunc) и инкубировали при 37њC в течение 30 - 40 мин, затем коллаген удаляли и культуральный сосуд трижды промывали раствором Хенкса.

О влиянии на клетки волосяного фолликула блокаторов кальциевых каналов судили по включению этими клетками 3H-тимидина. Для этого вместе с исследуемым фактором в культуру добавляли 3H-тимидин (1 мкКи/мл). После инкубации в течение 48 ч клетки промывали в растворе Хенкса, а затем в течение 10 мин обрабатывали холодным 5% раствором трихлоруксусной кислоты. Затем клетки лизировали 0,1 н. NaOH и вносили в сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность включившегося 3H-тимидина определяли на счетчике.

Результаты и обсуждение

Выделенные волосяные фолликулы прикреплялись к поверхности культурального сосуда примерно за 12 - 20 ч. В то же время наблюдалась миграция клеток из волосяного фолликула по поверхности субстрата. Уже через 48 - 72 ч вокруг прикрепившихся фолликулов наблюдались колонии клеток, часто различной морфологии. Среди мигрирующих клеток легко различались дифференцирующиеся эпидермальные и фибробластоподобные, вероятно папиллярные клетки. Образовавшиеся вокруг волосяных фолликулов колонии хорошо пролиферировали и мигрировали по поверхности субстрата. Впоследствии колонии значительно увеличивались в размерах и образовывали многослойные эпидермальные пласты, мало отличающиеся от пластов, формирующихся из кератиноцитов эпидермиса [5]. Кроме фибробластоподобных, в популяции можно было различить эпителиальные клетки, растущие из внешней оболочки волоса, и клетки, берущие начало из бульбарной области. Помимо морфологических различий, эпителиальные клетки, берущие происхождение из разных участков волоса, имеют различия в метаболических, функциональных и пролиферативных показателях [4]. В наших культурах легко различались клетки, берущие начало из бульбарной области (рис.1) и из внешней волосяной оболочки (рис.2). Хотя большинство культур, растущих из волосяных фолликулов, происходит из внешней корневой оболочки, наиболее функционально значимыми являются клетки из области формирования волоса. Эти так называемые герминативные клетки комитированы к дифференцировке в клетки волоса [7].

Рис.1. Бульбарная часть волоса, дающая начало эпидермальным и папиллярным клеткам.

Рис.2. Эпидермальные кератиноциты, растущие из внешней оболочки волоса в культуре.

В культуре эпидермальные клетки из внешней волосяной оболочки проявляют высокую пролиферативную активность, однако герминативные клетки пролиферировали только в присутствии папиллярных дермальных клеток или иных фибробластов. В этих условиях формирование значительных колоний герминативных клеток наблюдается к 6 - 8-м суткам.

Дермальные папиллярные клетки, растущие в культуре, представляют значительный интерес для исследований, поскольку в значительной мере влияют на формирование и функционирование волосяного фолликула [8].

Таким образом, в условиях культивирования клеток из волосяного фолликула открывается возможность создавать комбинации трех различных субпопуляций клеток, определяющих функционирование волоса. Именно эта система была использована нами для изучения влияния блокаторов кальциевых каналов на пролиферативные характеристики клеток волосяного фолликула.

Блокаторы кальциевых каналов привлекли наше внимание в качестве перспективных дерматологических лекарственных средств, способных селективно ингибировать пролиферацию эпидермальных кератиноцитов. Их применение, на наш взгляд, возможно при лечении ограниченных форм псориаза, атопического дерматита, некоторых других дерматологических заболеваний [9]. Препараты этого класса хорошо изучены и широко применяются в кардиологии.

Ряд антипролиферативных агентов, обладающих сходными механизмами действия, также применяется в дерматологии. Миноксидил - блокатор натриевых каналов, стимулирует рост волос. Подобное же действие проявляет и циклоспорин А, обладающий способностью ингибировать пролиферацию кератиноцитов в культуре [10].

В экспериментах по изучению влияния блокаторов кальциевых каналов - верапамила, форидона и активатора кальциевых каналов, BAY K, на включение 3H-тимидина в кератиноцитах, растущих из волосяных фолликулов, удалось выявить дозозависимый эффект этих агентов (рис.3). В концентрациях 10-6М верапамил и форидон стимулировали синтез ДНК в эпидермальных кератиноцитах, растущих из волосяных фолликулов, в то время как BAY K ингибировал этот синтез.

Рис.3. Влияние блокаторов кальциевых каналов на синтез ДНК в эпидермальных клетках, растущих из волосяного фолликула in vitro. 1 - контроль; 2 - верапамил (10-6M); 3 - форидон (10-6M); 4 -BAY K (10-6M).

Этот эффект несколько отличался от наблюдаемого действия блокаторов кальциевых каналов в культурах кератиноцитов, выделенных из биоптатов кожи. Таким образом, можно говорить о специфическом воздействии изучаемых агентов на клетки, растущие из волосяных фолликулов.

При повышении концентрации испытуемых агентов до 10-5М проявлялся антипролиферативный эффект всех агонистов кальциевых каналов. В ряде случаев ингибирование пролиферации эпидермальных кератиноцитов может приводить к усилению дифференцировки, что особенно важно при стимуляции роста волос.

Однако возможный эффект на рост волос связан не только с прямым действием блокаторов кальциевых каналов на кератиноциты волосяных фолликулов, но и с влиянием на микроокружение, в том числе капиллярное, волосяных фолликулов.

Наличие дозозависимого характера воздействия и возможности комбинировать различные антагонисты кальциевых каналов делает особенно перспективным исследование влияния этого типа агентов на рост волос.

Наличие информативных моделей in vitro позволяет изучать воздействие на клетки волосяных фолликулов различных комбинаций перспективных лекарственных средств.


Вестник дерматологии и венерологии, N 6-1998, стр. 56-58.

Литература

1. Philpott M., Green M., Kealey T. Human hair growth in vitro. J Cell Science 1990;97:463 - 471.

2. Rodent G., Martinet N., Steinert P. et al. Cultivation of murine Hair Follicles as organoids in a collagen matrix. J Invest Dermatol 1987;89:369 - 379.

3. Jindo T., Tsuboi R., Imai R. et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor stimulates hair growth of mouse vabrissae in organ culture. J Invest Dermatol 1994; 103: 306 - 309.

4. Detmar M., Schaart F.M., Blume U., Orfans C.E. Culture of hair matrix and follicular keratinocytes. J Invest Dermatol 1993;101:130S - 134S; J Invest Dermatol 1994;103:306 - 309.

5. Терских В.В., Васильев А.В. Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации. М:Наука 1995;104.

6. Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов чеовека и крысы. Цитология 1991;33:12:84 - 89.

7. Reynolds A., Lawrence C., Jahoda C. Human hair follicle germinative epidermal cell culture. J Invest Dermatol 1993;101:634 - 638.

8. Reynolds A., Jahoda C. Cultured dermal papilla cells induce follicle formation and hair growth by transdifferentiation of an adult epidermis. Development 1992;115:587 - 593.

9. Цветкова Г.М., Самсонов В.А., Парфенова М.Ю. Морфология изменений кожи морских свинок после обработки верапамиловой мазью. Вестн дерматол 1996;3:10 - 12.

10. Nikoloff B., Fisher G., Mitra R., Voorhees J. Additive and synergistic antiproliferative effects of cyclosporin A and gamma interferon on cultured human keratinocytes. Am J Path 1988;131:1:12 - 18.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования