Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Патологическая биохимия | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Сравнительный клинико-иммунохимический анализ ремиттирующего и вторично-прогрессирующего течения рассеянного склероза

Е.И. Гусев, И.А. Беляева, В.П. Чехонин, Т.Л. Демина, А.Н. Бойко, А.В. Буглак, О.И. Гурина

Кафедра неврологии и нейрохирургии N1 РГМУ, лаборатория иммунохимии Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского, Москва

В начало...


Проведен иммунохимический мониторинг ремиттирующего и вторично-прогрессирующего течения рассеянного склероза (РС). Обследование 61 пациента проводилось в течение 3 лет. Определялись в супернатантах мононуклеаров периферической крови провоспалительные цитокины - интерлейкины ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, фактор некроза опухолей $\alpha$, в сыворотке крови - нейроспецифические белки (GFAP иa 2-GP), везикулярно-целлюлярная молекула адгезии - sVCAM-1. Контрольную группу составили 50 доноров. Результаты исследования показали сохраняющееся функциональное напряжение клеточного иммунитета и снижение резистентности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) на всех стадиях РС. Однако при вторично-прогрессирующем РС концентрация sVCAM-1 в сыворотке крови оставалась повышенной по сравнению с контролем, - группой больных с ремиттирующим течением РС и при клиническом улучшении. Предполагается, что функциональное изменение эндотелия ГЭБ, выражающееся в постоянной патологической экспрессии молекулы sVCAM-1, является одним из патохимических механизмов, способствующих прогредиентности процесса при РС.

Рассеянный склероз (РС) относится к числу наиболее часто встречающихся поражений ЦНС из группы демиелинизирующих заболеваний. Как известно, в большинстве случаев после определенного периода времени, индивидуального для каждого больного, ремиттирующее течение РС переходит во вторично-прогрессирующее [1] с постепенным углублением неврологического дефицита, сокращением периодов клинической стабилизации, инвалидизацией пациентов. В то же время в 15-20% случаев [1] заболевание протекает мягко, когда при длительности болезни более 10 лет имеются минимальные неврологические симптомы. Патогенетические механизмы разных вариантов течения РС неясны. Существует мнение о возможном различии патогенеза развития воспалительных изменений в ткани мозга при ремиттирующем, первично- и вторично-прогрессирующем течении РС. Уточнение этого вопроса окажет существенное влияние на выбор адекватной терапии для каждой стадии болезни.

Современные знания о патогенезе РС подтверждают развитие комплекса иммунопатологических и патохимических реакций в нервной ткани [6, 7, 12]. Наиболее значимыми из них считаются трансмиграция активированных Т-лимфоцитов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), повышенная продукция Т1-хелперами провоспалительных цитокинов, возможность экспрессии молекул основного комплекса гистосовместимости (МСН) 2-го класса астро-глией, микроглией, эндотелием ГЭБ [1, 4, 7, 12]. Клеточные системы, имеющие на своих мембранах молекулы МСН 2-го класса, взаимодействуя с рецепторами Т-клеток, имеют возможность презентировать нейроспецифические белки (основной белок миелина, гликопротеины олигодендроглии) как антигены [7]. Результатом этой аутоиммунной воспалительной реакции являются очаговое разрушение миелина и гибель олигодендроцитов, развитие астроглиоза [5, 14]. Изменение функционального состояния эндотелия ГЭБ при РС оказывает активное влияние на развитие воспаления в ЦНС. Наблюдения, проведенные при хроническом экспериментальном энцефаломиелите, показали, что селективность миграции Т-лимфоцитов и моноцитов через ГЭБ связана с экспрессией эндотелием барьера мозга молекул адгезии - васкулярно-целлюлярной (VCAM-1) и интрацеллюлярной (ICAM) [4, 8, 9, 12]. Уровень растворимых молекул адгезии (sVCAM-1 и sICAM-1) в сыворотке крови прямо пропорционален их экспрессии на мембране эндотелия [4, 8].

Для РС характерно волнообразное клиническое течение. Вероятно, активность заболевания и особенности его течения связаны с разной степенью выраженности патогенетически значимых иммунохимических изменений в ткани мозга, нарушением связи между клеточными системами (эндотелий - нейроэктодермальные клетки - микроглия) и индивидуальными компенсаторными возможностями мозга.

Целью настоящей работы явилось проведение иммунохимического мониторинга патогенетически значимых параметров (провоспалительных цитокинов - интерлейкинов ИЛ-1-$\beta$, ИЛ-2, ИЛ-6, фактора некроза опухолей - ФНО-$\alpha$, а такжеVCAM-1, нейро-специфических белков - маркеров зрелых астроцитов кислого протеина GFAP и гликопротеина$\alpha$2-GP) при ремиттирующем и вторично-прогрессирующем течении РС и уточнение возможных патогенетических отличий разных вариантов течения РС.

Обследовали 61 пациента с РС (18 мужчин и 43 женщины). Из них у 37 (возраст от 13 до 45 лет) было ремиттирующее течение РС, у 24 (возраст от 21 до 51 года) - вторично-прогрессирующее. У всех больных был достоверный диагноз РС по критериям С. Роser и соавт. [10], подтвержденный в каждом случае данными магнитно-резонансной томографии (МРТ). Контрольную группу составили 50 доноров того же возраста.

Следует подчеркнуть, что иммунохимические показатели изучали в динамике у одних и тех же больных в течение года. Тяжесть состояния больных оценивали по шкале инвалидизации Куртцке [10]. Больные с суммой баллов по EDSS 4 и более составили группу с тяжелым и среднетяжелым течением болезни; в нее вошли 10 человек с ремиттирующим и 20 с вторично-прогрессирующим течением болезни. Группа больных с суммой баллов по EDSS менее 4, что соответствовало легкому течению заболевания, включала 27 человек с ремиттирующим и 4 с вторично-прогрессирующим течением РС. Выраженность неврологического дефицита, которую оценивали суммой баллов по шкалам FS [10], составила при ремиттирующем течении в среднем 8,8 2,28 балла, при вторично-прогрессирующем - 15,2 3,6 балла. Продолжительность заболевания колебалась от нескольких месяцев до 20 лет. В группе с ремиттирующим течением РС преобладали больные с длительностью заболевания 2-5 лет (65%), в группе с вторично-прогрессирующим течением - больные с анамнезом РС более 8 лет (65%). Среди пациентов с ремиттирующим течением РС у 3 отмечалось одно обострение в 3 года, у 29 - одно обострение в год и у 5 человек - два обострения в год.

В исследование были включены только пациенты, не получавшие кортикостероидов и других иммуносупрессивных препаратов не менее чем 3 мес до начала испытания.

Кровь для анализа брали в стерильных условиях. Использовали гепаринизированную (20 ЕД/мл) периферическую кровь, взятую натощак из локтевой вены в день обращения пациента и при последующих осмотрах. Методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке крови определяли концентрацию глиоспецифических белков - GFAP и $\alpha$2-GP [15]. Прорыв этих антигенов в кровь с последующим увеличением их концентрации в сыворотке крови позволяет установить надежный мониторинг проницаемости ГЭБ.

Диагностические тест-системы для определения уровня данных нейроспецифических белков разработаны на базе лаборатории иммунохимии ГНЦССП им. В.П. Сербского. При сопоставлении анти-GFAP- и анти-$\alpha$2-GP-антител с соответствующими препаратами антител, выпускаемыми фирмой "Sigma" (США), а также с соответствующими препаратами антител, любезно предоставленными нам K. Warecka, была показана их полная иммунохимическая идентичность. Тест-системы, разработанные на основе этих препаратов, позволяли надежно, воспроизводимо и специфично определять уровни GFAP и $\alpha$2-GP в сыворотке крови в интервале концентраций от 0,8 до 128 нг/мл.

Исследование синтеза и секреции провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-a) проводили в культуре мононуклеаров человека. Последние были получены из свежей культуры гепаринизированной крови путем центрифугирования в градиенте плотности "Histopague-1077" ("Sigma", США) [15]. 5•106/мл клеток были суспендированы в обогащенной культуральной среде RPMI-1640 ("Gibco", США) с 5% термоинактивированной сывороткой телят (FCS) и инкубированы при 37 њС в течение 1 ч. Неадгерентные клетки были отмыты из культурального планшета, а оставшиеся клетки пассировали в обогащенной среде RPMI-1640 c добавлением 10 мкг/мл липополисахарида ("Sigma", США) в течение 6 ч. Супернатант исследовали для оценки количественного содержания ИЛ-1b при помощи ELISA cit. ("Cistrom Biotechnology", США) [15].

Исследование ИЛ-2 проводили следующим образом. Мононуклеарные клетки человека (5•106/мл) суспендировали в обогащенной культуральной среде RPMI-1640 ("Gib-co", США), содержавшей 10% термоинактивированной FCS, а также 2 ммоль L-глутамина, 10 ммоль незаменимых аминокислот, 2 ммоль пирувата натрия, 5 ммоль $\beta$-меркаптоэтанола, и инкубировали при 37 њС в присутствии 1 мкг/мл фитогемагглютинина ("Gibco", США) в течение 48 ч. Супернатант собирали и хранили при 4 њС до количественного исследования ИЛ-2. Последнее проводили методом ELISA cit. ("Cistrom Biotechnology", США) [15] согласно прилагаемой инструкции.

Культуру мононуклеаров для определения ФНО-$\alpha$ и анализа ИЛ-6 готовили так же, как для ИЛ-1 и ИЛ-2. Количественный анализ ФНО-a, ИЛ-6 в первичном супернатантеосуществляли методом ELISA cit. ("Cistrom Biotechnology", США) [15].

Уровни VCAM-1 определяли в образцах сыворотки крови путем твердофазного иммуноферментного анализа коммерчески доступными тест-системами моноклональных антител - "анти-VCAM-1" в соответствии с инструкцией изготовителя ("Sigma", США).

МРТ выполняли на томографе <Сигна-Горизонт> (фирма <Дженерал Электрик>, США) с напряженностью магнитного поля 1,5Т. Исследования проводили по методике Института нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко РАМН с использованием стандартных Т2- и Т1-взвешенных изображений, а также с применением импульсных последовательностей FLAIR и спинового эхо с эффектом переноса намагниченности (SE-MTS). Исследование выполняли до и после введения контрастного вещества. Кроме этого, проводили динамическую МРТ после внутривенного контрастирования в течение 60 мин (через 5, 30 и 60 мин). Для внутривенного контрастирования использовали препарат <Омнискан> фирмы <Никомед> в стандартной дозе 0,2 мл/кг.

Для статистической обработки материала применяли пакет Biological Medical Data Programm. Для анализа полученных данных с учетом характера течения заболевания всех больных разделили на две группы. При прогредиентности процесса из 24 пациентов более чем у 50% ухудшение происходило 2 раза в год и чаще. В каждом случае новой экзацербации больных включали повторно в группу с обостре-нием заболевания (табл. 1,табл. 2). Клинически обострение продолжалось от 3-4 нед до 4 мес. В 1-й группе у 80% пациентов его длительность не превышала 4 нед, во 2-й у 50% оно продолжалось более 4 нед и у 20% - около 4 мес (см. табл. 2). Мы не отметили связи между длительностью обострения и тяжестью заболевания по шкале EDSS. Как показал ретроспективный анализ историй болезни, пациенты с РС за медицинской помощью обращались на 9-14-й день от появления первых клинических признаков обострения заболевания. В 30% случаев при обращении пациентов к неврологу по месту жительства изменение их самочувствия не было расценено как обострение процесса, что подтверждает актуальность своевременной объективизации активности болезни.

Таблица 1. Динамические показатели провоспалительных цитокинов, молекул адгезии и нейроспецифических белков при обострении РС
Обострение ИЛ-1,пг/мл ИЛ-2,ед./мл ИЛ-6,пг/мл ФНО-$\alpha$,пг/мл sVCAM-1,нг/мл GFAP,нг/мл $\alpha$2-GP, нг/мл
До 14 дней (n=42) 1,98 0,08* 20,07 0,29* 16,42 0,42* 1846,67 203,90* 1767 167* 32,50 2,77 27,14 1,50*
28-30 дней (n=42) 2,12 0,13* 19,65 0,34* 16,78 0,54* 1852,14 191,71* 1930 208* 33,20 2,74* 26,52 1,91*
До 2 мес (n=38) 2,25 0,20* 19,33 0,41* 17,28 0,56* 1860,50 295,65* 1785 242* 36,36 4,36* 27,00 3,81*
Подострый период (n=42) 1,92 0,07* 20,36 0,21* 15,48 0,35* 1696,18 102,01* 1344 111* 26,00 1,97* 22,43 1,52*
Kонтроль 1,64 0,01 22,02 0,04 3,72 0,01 800 0,23 880 40 4,80 0,34 4,41 0,22
Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3 звездочкой отмечены достоверные различия с контролем (р<0,01).

Таблица 2. Динамические показатели провоспалительных цитокинов, молекул адгезии и нейроспецифических белков при прогредиентном течении РС
Обострение ИЛ-1,пг/мл ИЛ-2,ед./мл ИЛ-6,пг/мл ФНО-$\alpha$,пг/мл sVCAM-1,нг/мл GFAP,нг/мл $\alpha$2-GP, нг/мл
Ухудшение:
1 мес (n=36) 2,18 0,11* 19,77 0,25* 16,69 0,51* 1794,11 235,18* 1656 196* 32,83 3,67* 29,59 3,20*
2 мес (n=12) 2,08 0,11* 19,95 0,26* 16,49 0,45* 1895,33 170,63* 1844 779* 33,28 3,05* 26,21 1,49*
4 мес (n=5) 2,19 0,20* 19,68 0,43* 15,66 0,89* 1701,14 215,55* 1527 274* 22,55 2,82* 21,27 2,99*
Улучшение:
1 мес (n=24) 1,82 0,03* 20,77 0,22 14,95 0,54* 1423,17 138,97* 1000 104* 17,71 2,25* 15,60 1,42*
3-4 мес (n=24) 1,79 0,03* 21,15 0,19 14,43 0,49* 1352,17 108,05 945 135* 14,86 0,78* 12,26 1,07*
более 6 мес(n=12) 1,75 0,04* 21,25 0,27 13,21 1,0* 1126,57 131,54* 1100 300* 14,22 2,59* 12,13 2,64*
Примечание. Контрольные значения см. в табл. 1.

На фоне уже имеющегося стойкого неврологического дефицита при вторично-прогрессирующем течении РС вновь возникающее обострение проявляется клинически не так ярко, как при ремиттирующем течении, что затрудняет его своевременную диагностику и оценку тяжести состояния пациента. В то же время, несмотря на меньшую клиническую выраженность экзацербации (определялось нарастание числа баллов по шкале EDSS) во 2-й группе, степень иммунохимической активности (остроты) процесса была равноценной (см.табл. 1,табл. 2). Таким образом, сопоставив клинические симптомы, уровень провоспалительных цитокинов, молекул адгезии sVCAM-1, нейро-специфических белков во время обострения (все показатели достоверно отличались от контроля: р<0,01) в 1-й и 2-й группах пациентов, мы выявили при вторично-прогрессирующем течении РС клинико-иммуохимическую диссоциацию.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования