Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Научные статьиНегативное действие экзогенной ДНК на оплодотворение и ранний эмбриогенез кролика в опытах по опосредованному сперматозоидами переносу генов: picthree

Научные статьиТрансфекция маточного эпителия при осеменении крольчих трансформированными сперматозоидами. Модель интернализации ДНК в спермий: Литература

Перколяция чужеродной ДНК в геном при оплодотворении

А.В. Кузнецов, А.Б. Жаданов, И.В. Кузнецова, И.Ю. Щит

ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, Московская область, Институт молекулярной биологии РАН, Москва

В начало...


Сперматозоиды кролика использовали для доставки чужеродной ДНК в ооциты. Эякулированные спермии, отмытые от семенной плазмы, инкубировали в растворе Эрла со смесью кольцевых молекул и линейных фрагментов плазмиды pRK3lacZ. Крольчих искусственно осеменяли трансформированными сперматозоидами. В одной из трех серий экспериментов показано, что 73% потомков содержат 0,04-0,4 копии трансгена на геном.

Ключевые слова:

ДНК, сперматозоиды, ферментативная активность.

За последние годы методические приемы получения трансгенных мышей достигли технического совершенства и получили теоретическое обоснование [1]. Именно этим объясняется стремление исследователей при переходе на другие объекты следовать сложившейся методологии. Тем не менее из-за различий в строении и функционировании репродуктивной системы и ряда причин, связанных с индивидуальным развитием, методы трансгенеза, хорошо зарекомендовавшие себя на мышах, трудно реализуются при работе с особями других видов [2]. В этой связи представляется актуальным поиск новых путей получения трансгенных животных. С общебиологической точки зрения наиболее привлекательным выглядит использование сперматозоидов в качестве естественного вектора для переноса чужеродной ДНК (чДНК) в яйцеклетку. Таким способом были созданы трансгенные мыши [3, 4], свиньи [5], куры [6] и пчелы [7], причем эффективность процедуры составляла 30-60% [3, 6, 7]. В ряде случаев было показано, что трансгены способны экспрессироваться и передаваться потомству [3, 6].

В предшествующих экспериментах мы обрабатывали спермии кролика плазмидой рRK3lасZ, искусственно осеменяли крольчих и наблюдали экспрессию гена lасZ в доимплантационных эмбрионах до стадии морулы включительно [8]. В настоящей работе была предпринята попытка получить трансгенных животных. Поскольку имеются факты, свидетельствующие о существовании в клетках эукариот селекции, которая направлена против вирусных и бактериальных последовательностей ДНК [9, 10], в опытах использовали разные формы плазмиды pRK3lacZ.

Материалы и методы

Конструирование плазмиды pRK3lacZ. Регуляторную область RSV-LTR вырезали из плазмиды pRSV-lacZ [11] рестриктазами NdeI и HindIII, обрабатывали фрагментом Кленова в присутствии dNTP и клонировали в затупленный сайт XbaI плазмиды pUC19. В результате была получена плазмида pRSV1. Концевую область гена bGH с участками сплайсинга и полиаденилирования вырезали из плазмиды pGL3 [12] рестриктазами PstI и KpnI и клонировали в сайт SmaI вектора pUC19 описанным выше способом. Получили плазмиду pK3. Далее плазмиды pRSV1 и pK3 расщепили смесью рестриктаз BamHI и HindIII, выделили фрагменты, содержащие RSV-LTR и bGH-pUC19, а затем лигировали их. Таким образом, получили вектор pRSVK3, содержащий все необходимые участки для транскрипции и созревания молекул мРНК. Из плазмиды pLZ4 [13] с помощью рестриктаз BamHI и SalI вырезали полусинтетический ген $\beta$-галактозидазы E.coli. Участок ДНК с геном lacZ обрабатывали фрагментом Кленова и клонировали в предварительно затупленный BamHI-caйт вектора pRSVK3. Полученную плазмиду назвали pRK3lacZ (рис. 1). В экспериментах по трансформации использовали HindIII, KpnI-рестрикты плазмиды pRK3lacZ или смесь кольцевых и линейных молекул ДНК в соотношении 4:1.

Рис. 1. Физическая карта плазмиды pRK3lacZ.

Плазмида pRK3lacZ состоит из следующих частей: 3'-фрагмент длинного концевого повтора провируса саркомы Рауса (RSV-LTR), который содержит сигналы инициации транскрипции; полусинтетический ген lacZ, кодирующий бактериальный фермент $\beta$-галактозидазу; 3'-концевой участок генагормона роста быка (bGH), содержащий сигналы сплайсинга, полиаденилирования и терминации транскрипции; вектор pUC19.

Подготовка сперматозоидов и осеменение крольчих. Кроличью сперму получали от половозрелых самцов породы советская шиншилла с помощью искусственной вагины. Кроликов содержали в следующем половом режиме: 1 садка не чаще, чем в 3 дня, и не реже, чем в неделю. В эксперименте использовали эякуляты, содержащие не менее 80% подвижных спермиев. Активные сперматозоиды отделяли от неподвижных флотацией в 10-кратном объеме раствора Эрла. Суспензию подвижных клеток дважды центрифугировали при 200 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в растворе Эрла (содержит 50 мМ CaCl2 и 100 мМ KCl) и разводили до конечной концентрации 107 клеток в 1 мл. К 500 мкл суспензии добавляли в 50 мкл буфера ТЕ HindIII, KpnI-рестрикты ДНК pRK3lacZ или смесь указанных линейных фрагментов плазмиды с ее кольцевой формой и тщательно перемешивали. Далее сперматозоиды инкубировали 15-30 мин при комнатной температуре (естественная трансформация), либо проводили инкубацию в присутствии 3% диметилсульфоксида (DMSO) с последующей температурной обработкой (4oC → 42oC, 2 мин) или без нее (искусственная трансформация). Самок в фазе эструса осеменяли при помощи катетера трансформированными спермиями. Сразу после осеменения внутривенно вводили по 100 МЕ хорионического гонадотропина. Контрольные эксперименты осуществляли без использования ДНК pRK3lacZ.

Выделение геномной ДНК [14]. Измельченные кусочки тканей (50 мг) инкубировали на качалке при 50оС в течение ночи в 700 мкл раствора следующего состава: 50 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ EDTA, 100 мМ NaCl, 1% SDS, 100 мкг/мл протеиназы К ("Sigma", США). Утром добавляли 5 мкл РНКазы А (1 мг/мл, "Sigma") и инкубировали при 37оС в течение 1 ч. Далее вносили 700 мкл фенола, насыщенного ТЕ, и осторожно перемешивали до гомогенного состояния в течение 20 мин. Фазы разделяли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 15 мин. К верхней вязкой водной фазе приливали 700 мкл смеси фенол-хлороформ (1:1, об/об), уравновешенной ТЕ и содержащей 1:50 (об/об) изоамилового спирта, аккуратно перемешивали и центрифугировали при тех же условиях. К верхней фазе добавляли 1 мл 96% этанола, аккуратно перемешивали и осаждали ДНК центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин). Осадок промывали 1 мл 70% этанола, снова центрифугировали, подсушивали в вакууме и растворяли в 200 мкл ТЕ, инкубируя на качалке в течение 2 ч при 37оС. Если величина отношения А260280 в образце была ниже 1,7, проводили повторную экстракцию смесью фенол-хлороформ. Целостность высокомолекулярной ДНК проверяли электрофорезом в 0,8% агарозном геле [15].

Подготовка радиоактивного гибридизационного зонда. ДНК pRK3lacZ метили [$\alpha$-32P] ATP (ИЯФ, Обнинск) при помощи реакции ник-трансляции, используя ник-набор фирмы "Fermentas" (Литва), согласно инструкции производителя. Активность ДНК [32P]-pRK3lacZ составляла 1010 имп/мин х мл. К зонду добавляли ДНК из спермы лосося (100 мкг/мл) и денатурировали на кипящей водяной бане в течение 10 мин.

Иммобилизация хромосомной ДНК на фильтре [16]. Капроновые мембраны "Хииу-калур" (Эстония) предварительно выдерживали 15 мин в 10хSSPE. ДНК-пробу (10 мкг) и контрольныеразведения плазмиды pRK3lacZ смешивали с 10 мкг ДНК из спермы лосося, денатурировали нагреванием в течение 10 мин при 95оС и наносили в точки при помощи прибора Dombi-Dot (Диа-М, Россия). Связанную ДНК пришивали к высушенным фильтрам под УФ-лампой на расстоянии 15 см в течение 20 с.

Рестрикция хромосомной ДНК эндонуклеазой EcoRI, Саузерн-блотинг [15]. Образцы ДНК по 10 мкг гидролизовали 200 ед. рестриктазы EcoRI при 37оС в течение ночи и разделяли при помощи электрофореза в 0,8% агарозе. Денатурацию ДНК в геле проводили в течение 1 ч с помощью буфера, содержащего 0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl. Далее гель нейтрализовали в буфере: 1 М Трис-HCl (pH 8,0), 1,5 M NaCl. Капиллярный перенос ДНК-фрагментов на нейлоновые фильтры Hybond-N ("Amersham", Англия) осуществляли с помощью 10хSSC в течение 12 ч.

Гибридизация и радиоавтография [17]. Предгибридизацию проводили в течение 2 ч при 65оС в растворе следующего состава: 5хSSPE, 0,3% SDS,100 мкг/мл ДНК из спермы лосося. Гибридизацию с зондом осуществляли в том же растворе при 65оС в течение ночи. Фильтр четырежды отмывали при 45оС по 10 мин в 250 мл раствора: 2хSSPE, 0,2% SDS. Радиоавтографию проводилис рентгеновской пленкой РМ-1 ("Тасма", Россия) в присутствии усиливающих экранов в течение 1 и 4 нед при -20оС.

Определение $\beta$-галактозидазной активности. Ферментативную активность бактериальной $\beta$-галактозидазы (КФ 3.2.1.23) определяли по цветной реакции с хромогенным субстратом CPRG ("Boehringer Mannheim", Германия). Для этого сыворотку крови анализируемых животных смешивали в соотношении 1:4 (об/об) с раствором следующего состава: 3,29 мМ CPRG, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 0,1% NaN3 (масса/об), 1% BSA (масса/об), 150 мкг/мл хлороквина, 100 мМ HEPES (pH 7,0) и инкубировали при 30оС в течение ночи. Интенсивность окрашивания оценивали спектрофотометрически (ламбда=574 нм).

Результаты

Общие итоги опыта, результаты точечной гибридизации с зондом [32P]-pRK3lacZ. Эксперименты по обнаружению перенесенной спермиями кролика ДНК pRK3lacZ у новорожденных особей, взрослых животных и их потомков проводили в 1992-1993 гг. Опробовали приемы естественной и искусственной трансформации сперматозоидов. Было проведено 3 серии опытов.

Серия 1. Эякулят получали от кроликов N 1-4. Отмытые от семенной жидкости сперматозоиды инкубировали с HindIII, KpnI-рестриктами плазмиды pRK3lacZ (5-10 мкг/мл) в течение 15-30 мин при комнатной температуре в растворе Эрла. После этого суспензию клеток разбавляли тем же раствором и проводили искусственное осеменение. Из 10 самок животные A2, A3, A8 и A9 родили 26 крольчат, которые были исследованы при помощи дот-гибридизации на содержание чужеродных последовательностей ДНК. Положительные сигналы зарегистрированы не были.

Серия 2. В опыте использовали сперму от самцов N 2-4. После флотации и отмывки клеток от семенной плазмы в растворе Эрла к ним дробно добавляли DMSO - сначала до 1%, а через 10 мин инкубации спермиев при комнатной температуре с 10 мкг/мл плазмиды pRK3lacZ, линеаризованной по HindIII и KpnI сайтам, - до 3%. Затем суспензию охлаждали в течение 20 мин до 4oC и проводили тепловой шок (42oC, 2 мин). В результате осеменения крольчих D7-D14 было получено 35 крольчат, из которых 29 особей исследовали с помощью дот-гибридизации. Как и в предыдущем случае, позитивные животные выявлены не были.

Серия 3. С целью отмыть спермии от семенной жидкости эякуляты кроликов N 3-5 обрабатывали при помощи флотации и центрифугирования. Во всех вариантах опыта трансформацию сперматозоидов проводили в 500 мкл раствора Эрла в присутствии 2,5 мкг HindIII, KpnI-рестриктов плазмиды pRK3lacZ и 10 мкг кольцевой ДНК pRK3lacZ. В первом случае после 30 мин инкубирования суспензии клеток и ДНК при комнатной температуре были осеменены 3 самки: C1, C2 и C3. Во втором - к отмытым сперматозоидам сначала добавили DMSO до 1%, затем ДНК, после этого смесь проинкубировали в течение 10 мин, добавили DMSO до 3% и инкубировали еще 20 мин при комнатной температуре. Трансформированными спермиями обработали крольчих N C4-C6. В третьем случае после добавления DMSO до 1% и соответствующего количества ДНК, последующего инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре и повторного добавления DMSO до 3%, смесь охлаждали до 4o C в течение 20 мин и затем нагревали до 42o C за 2 мин. Трансформантами осеменили самок N C7-C12, часть из которых принесла потомство. Всего от крольчих N C1-C12 было получено 49 детенышей, из них 44 исследованы при помощи дот-гибридизации. В 32 (72,7%) случаях при гибридизации с зондом [32P]-pRK3lacZ зарегистрирован положительный сигнал (см. табл. 1). В этих образцах обнаружено 0,1-1 пг искомой ДНК на 10 мкг хромосомной ДНК, что составляет менее 1 копии плазмиды pRK3lacZ на геном (~0,04-0,4). Зонд не гибридизовался с ДНК из контрольных животных (рис. 2).

Таблица 1. Итоги серии опытов N3.
Трансформация спермиев Реципиент Число крольчат
рожденных исследованных с положительным сигналом
Естественная C1 14 12 {N 1-12} 11
C2 8 7 {N 13-19} 5
C3 8 8 {N 20-27} 8
Всего 30 27 (100%) 24 (88,9%)
Искусственная C5 1 1 {N 28} 1
C11 14 14 {N 29-42} 6
C12 4 2 {N 43-44} 1
Всего 19 17 (100%) 8 (47,1%)
Итого 49 44 (100%) 32 (72,7%)

Рис. 2. Дот-гибридизация зонда [32P]-pRK3lacZ с хромосомной ДНК.

а1 - ДНК контрольного кролика; а2-а10 - разведения плазмиды pRK3lacZ (от 1 мкг до 0,01 пг); б1-г7 - ДНК полученных крольчат N 1-27.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования