Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посмотрите новые поступления ... Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Созревание ооцитов внутри фолликулов с разной степенью развития микроциркуляторного русла

Т.А. Смирнова, Л.Д. Галиева

Всероссийский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Ст.-Петербург, г. Пушкин

В начало...


Описана динамика созревания ооцитов внутри фолликулов с разной степенью развития микроциркуляторного русла. Установлено, что созревание ооцитов в интактных и 1-й степени атрезии фолликулах диаметром 2-5 мм происходит медленнее, чем в фолликулах 2-й степени атрезии. При оплодотворении яйцеклеток, созревших в интактных фолликулах и в фолликулах 1-й степени атрезии, получены эмбрионы.

Ключевые слова:

ооциты, фолликулы, антральные, яичники, коровы.

Метод интрафолликулярного культивирования ооцитов разработан в начале 70-х годов. Основной причиной разработки этого метода послужило то обстоятельство, что при извлечении ооцитов из фолликулов нарушаются связи между ооцитом и клетками фолликула. Это приводит к изменениям структуры ооплазмы и ее функций. Надо полагать, что для созревания ооцитов необходимо участие многих элементов фолликулов [4]. Неудивительно, что в последнее время для полноценного созревания изолированных ооцитов используют совместное культивирование с клетками фолликулов. Интрафолликулярное культивирование представляет большой интерес в научном плане, так как этот способ позволяет изучать закономерности процессов, происходящих в фолликуле [15]. Целью настоящей работы являлось изучение изменений структур интактных и атретических фолликулов до и в процессе их культивирования, а также способности к оплодотворению яйцеклеток, созревших внутри фолликула, и дальнейшему развитию эмбрионов.

Материалы и методы

Выделение и оценка фолликулов

Антральные фолликулы диаметром 2-5 мм выделяли из яичников коров в разных стадиях полового цикла. При этом фолликулы со слабым тургором, "белесые", "серые", с темными пятнами в опытах не использовали. Выделенные фолликулы оценивали по состоянию и степени развития микроциркуляторного русла (МЦР) [1, 2]. Степень развития МЦР оценивали по 5-балльной системе. По исследуемым признакам популяция фолликулов была разделена на 4 группы: 1-я группа - фолликулы с обширной васкуляризацией, представленной плотной сетью капилляров без признаков дегенерации. Контуры сосудов ровные, без расширений, прерывистости (интактные фолликулы); 2-я группа - фолликулы с развитым МЦР, представленным более крупными микрососудами без признаков дегенерации (1-я степень атрезии); 3-я группа - фолликулы со слаборазвитым МЦР без признаков дегенерации, сеть капилляров отсутствовала (2-я степень атрезии); 4-я группа - фолликулы, МЦР которых имело признаки дегенерации (неровность контура, прерывистость сосудов) (3-я степень атрезии).

Культивирование фолликулов

Культивирование фолликулов проводили в роллерной установке в закрытых сосудах со специальной газовой смесью: 5% CO2, 55% O2, 40% N2. Время инкубации 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 ч. В качестве культуральной среды использовали Ham F-10 с добавлением FCS (20%), ФСГ (5 мкг/мл), ЛГ (5 мкг/мл), эстрадиола (1 мкг/мл), инсулина (1 мкг/мл).

В результате предварительных исследований установлено, что в процессе культивирования фолликулов 1-й и 2-й групп между ними не существует выраженных морфологических и цитологических различий, поэтому фолликулы этих групп были объединены. Фолликулы 4-й группы для культивирования не использовались из-за глубоких деструктивных изменений всех их составных структур.

Оплодотворение ооцитов, созревших внутри фолликулов

Яйцеклетки, созревшие в фолликулах, выделяли и осеменяли капацитированными сперматозоидами быка. Продолжительность совместной инкубации яйцеклеток со сперматозоидами составляла 24 ч, после чего клетки переносили в свежеприготовленную среду. Первый просмотр клеток проводили через 28 ч после осеменения. При обнаружении признаков оплодотворения - наличие второго полярного тельца и борозды дробления - яйцеклетки инкубировали 24 - 78 ч.

Гистологический и цитогенетический методы

Через каждые 6 ч культивирования проводили гистологическое исследование фолликулов и готовили препараты мейотических хромосом. Фолликулы фиксировали в растворе Буэна, Карнуа. Заливку осуществляли через парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм, проходящие через ядро ооцита, окрашивали гематоксилином по Эрлиху или Бемеру [16].

Препараты мейотических хромосом ооцитов готовили по методу Тарковского и окрашивали раствором Гимзы.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением критерия Стьюдента и критерия х2.

Результаты

Для гистологического анализа было использовано 80 интактных фолликулов, по 20 фолликулов в каждой группе. Результаты гистологического анализа показали, что степень развития и состояние МЦР фолликулов коррелируют с состоянием всех клеточных структур фолликулов [1, 2, 5]. Фолликулы исследовали в зависимости от цикла яичника, степени развития и состояния МЦР (табл.1).

Таблица 1. Соотношение интактных и атретических фолликулов в яичнике
Диаметр фолликулов, мм Общее число исследованных фолликулов Число (в %) фолликулов
интактные степень атрезии, %
1-я 2-я 3-я всего
Яичники в стадии фолликулярного роста
2-3 78 17,8 20,5 61,6 - 82,1
4-5 118 3,4 35,6 49,1 11,9 96,6
Итого 196 9,2 29,6 54,1 7,1 90,8
Яичники в ранней лютеиновой стадии
2-3 74 - 26,9 73,0 - 99,9
4-5 112 3,6 33,9 51,8 10,7 96,4
Итого 186 2,1 31,2 60,2 6,5 97,9
Яичники на стадии развитого желтого тела
2-3 100 12,0 20,0 62,0 6,0 88,0
4-5 196 4,1 40,8 39,8 15,3 95,9
Итого 296 6,7 33,8 47,3 12,3 93,3

Как видно из табл. 1, 82,1 - 99,9% фолликулов, выделенных из яичников разных стадий цикла, являлись атретическими, в том числе 90,8% на стадии фолликулярного роста, 97,9% на ранней лютеиновой стадии и 93,3% на стадии развитого желтого тела. Наибольшее число интактных фолликулов содержалось в яичниках на стадиях фолликулярного роста и развитого желтого тела (9,2 и 6,7%).

Изучение состояния хроматина ооцитов, выделенных из фолликулов с различной степенью развития МЦР, показало, что в фолликулах с обширной васкуляризацией (1-я группа) ядерный материал ооцитов не имел признаков дегенерации. При уменьшении васкуляризации фолликулов 2-й и 3-й групп наблюдали возрастание числа ооцитов с признаками дегенерации хромосом (15,7 и 42,8% соответственно). Максимальное число (73,5%) таких ооцитов находилось в фолликулах с признаками дегенерации МЦР (4-я группа).

Таким образом, результаты цитологического анализа ооцитов, выделенных из фолликулов с различной степенью развития МЦР, свидетельствуют, что фолликулы с обширной и развитой степенью васкуляризации (1-я и 2-я группы) имеют наименьшее число ооцитов с признаками дегенерации хромосом.

Изучение динамики созревания интактных и 1-й степени атрезии интрафолликулярных ооцитов (1-я и 2-я группы) показало, что максимальное число ооцитов (47,8%) достигало стадии метафазы I без признаков дегенерации за 24 ч культивирования, а метафазы II - за 30 ч культивирования 63,2% (табл. 2). На всех стадиях мейоза доля ооцитов с признаками дегенерации ядерного материала оставалась низкой.

Таблица 2. Динамика созревания ооцитов в интактных фолликулах и фолликулах 1-й степени атрезии
Время культивирования, ч Число фолликулов Ооциты, %
диплотена метафаза I телофаза I - метафаза II
норма дегенерация норма дегенерация норма дегенерация
0 45 90,6 8,6 0,2 0,2 - 0,4
6 40 87,0 8,0 4,6 0,2 - 0,2
12 42 62,0 1,3 20,0 - 16,7 -
18 56 31,1* 3,0 42,6** 0,8 20,7 1,8
24 124 15,7* 2,9 47,8** 1,4 30,2* 2,0*
30 46 10,0* - 25,6** 1,2 63,2* -
36 43 7,6* 5,4 23,0** 1,6 58,8* 3,6**
42 49 7,3* 6,1 22,0** 6,0 54,0 4,6**
Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * - p<0,05, ** - p<0,001.

При культивировании фолликулов 2-й степени атрезии (3-я группа) (табл. 3) резко возрастало число ооцитов, имеющих хромосомы с признаками дегенерации (деконденсация, фрагментация, слипание) на всех стадиях мейоза.

Таблица 3. Динамика созревания ооцитов в фолликулах 2-й степени атрезии
Время культивирования, ч Число фолликулов Ооциты, %
диплотена метафаза I телофаза I - метафаза II
норма дегенерация норма дегенерация норма дегенерация
0 90 44,4 37,8 2,2 2,2 10,0 4,4
6 38 39,8 34,4 10,1* 5,0 5,0 5,7
12 40 20,0 30,0 20,0** 10,0** 20,0** -
18 39 17,4 17,4 19,7** 19,4** 15,9 10,2*
24 94 14,9 15,9* 19,3** 20,2** 15,9 13,8*
30 47 14,0 3,6** 5,9 35,3* 23,6** 17,6**
36 46 7,5* 26,0 - 16,8** 16,6** 33,3**
42 43 3,8* 40,8 - - 13,4 42,0**
Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия по отношению к контролю (время культивирования 0 ч): * p<0,05; ** p=0,01.

Таким образом, культивирование интактных фолликулов (1-я группа) и фолликулов 1-й степени атрезии (2-я группа) не сопровождается проявлениями атретических процессов, в то время как при культивировании фолликулов 2-й степени атрезии (3-я группа) наблюдается усиление признаков дегенерации хромосом на всех стадиях мейоза.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования