Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Новый противоопухолевый препарат циклоплатам: цитотоксичность и межнитевые сшивки ДНК

Горбачева Л.Б., Васильева С.В., Махова Е.В., Мошковская Е.Ю., Соколова И.С., Тихомиров А.Г., Дедерер Л.Ю.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва

В начало...


Впервые изучены генетические механизмы цитотоксичности, такие как индукция SOS-репарационного процесса, эксцизионная репарация и образование межнитевых сшивок, индуцированных новым противоопухолевым препаратом аммин (циклопентиламин)-S(-) малатоплатиной (II) или циклоплатамом, в сравнении с известным препаратом цис-дихлордиамминоплатиной (II) (ДДП) в модельной системе Escherichia coli. В клетках E.coli цитотоксичность циклоплатама была существенно ниже, чем ДДП. Оба препарата индуцировали SOS-репарационный процесс в E.coli PQ37; ДДП была в 20 раз более эффективна, чем циклоплатам в концентрации 25 мкМ. В интервале концентраций 40-100 мкМ эти различия нивелируются. Оба препарата вызывают образование межнитевых сшивок в образцах очищенной ДНК тимуса теленка и E.coli. При инкубации клеток дикого штамма E.coli AB1157 с обоими препаратами только ДДП вызывала образование межнитевых сшивок ДНК. Таким образом, не удалось обнаружить корреляции между образованием межнитевых сшивок ДНК, индуцированных циклоплатамом или ДДП, и цитотоксичностью этих препаратов.

Ключевые слова:

циклоплатам, цитотоксичность, межнитевые сшивки ДНК.

В настоящее время производные цис-дихлордиамминоплатины (II) (ДДП) широко используются в химиотерапии некоторых форм опухолевых заболеваний [1]. Однако серьезным ограничением для применения ДДП и ряда ее производных первого поколения является их выраженная нефро- и нейротоксичность.

Новый перспективный отечественный препарат аммин (циклопентиламин)-S(-) малатоплатина (II) или циклоплатам относится к числу комплексных соединений платины второго поколения [2]. Этот препарат характеризуется значительно более низкой цитотоксичностью, чем ДДП, и высокой противоопухолевой активностью на широком спектре экспериментальных опухолей и, что крайне важно, отсутствием полной перекрестной устойчивости с ДДП [3, 4]. В настоящее время успешно завершена вторая фаза клинических испытаний циклоплатама.

Предполагается, что главной мишенью ДДП в клетке является ДНК. ДДП ковалентно связывается с N7 гуанина в составе ДНК с образованием монофункциональных аддуктов, которые затем реагируют с соседним пурином этой же или комплементарной цепи ДНК с образованием бифункциональных внутри- и межнитевых сшивок [5]. Последние возникают со сравнительно низкой частотой 1-2% [5]. Несмотря на то, что механизмы цитотоксичности ДДП окончательно не выяснены, доминирует представление, что именно наличие сшивок в ДНК препятствует репликации и транскрипции ДНК [6, 7].

Поскольку генетические механизмы цитотоксичности циклоплатама ранее не изучались, целью нашего исследования было сравнительное определение вклада межнитевых сшивок ДНК в процессы ингибирования репликации ДНК у E.coli и общую цитотоксическую активность, а также зависимость последней от функционирования системы эксцизионной репарации. Учитывая перспективу широкого клинического применения циклоплатама, необходимость таких исследований очевидна.

Материал и методы

В работе были использованы следующие штаммы E.coli K-12: AB1157 F-thrAI leu-6 thi-I proA2 his-4 argE3 lacYI galK2 ara-14 xyl-5 mtl-1 tsx-33 str-31 supE44; AB1886 - uvrA6 мутант АВ1157 - для изучения цитотоксичности препаратов в зависимости от активности систем эксцизионной репарации и PQ37 (sfi A::Mud(AP lac) cts lacDU169 mal+uvrA galE galY PhoCrfa F- thr leu his pyrD thi trp::Muc+ srl 300::Th10) для изучения SOS-индукция. Существенно, что основой при конструировании штамма E.coli PQ37 был штамм E.coli AB1886. Первые два штамма получены от П. Говард-Фландерса (США), последний от М. Хофнунга (Франция). Определение выживаемости (колониеобразующей способности) клеток E.coli проводили по стандартной методике серийных разведений [8].

Изучение индукции SOS-репарационного процесса проведено в соответствии с методологией SOS-Хромотест. В ос-нове метода - индикаторный штамм E.coli РQ37, в котором структурный ген бета-галактозидазы lacZ помещен под контроль одного из генов SOS-регулона sfiA. Экспрессия этого гена, индуцируемая повреждениями ДНК, измеряется не прямо, а опосредованно - путем регистрации активности бета-галактозидазы в простом колориметрическом тесте. Для количественной оценки SOS-репарационного процесса в системе SOS-хромотест принят показатель SOS-индуцирующего потенциала (SOSIP) [9].

Межнитевые сшивки ДНК определяли в образцах очищенной ДНК тимуса теленка и E.coli, инкубированных с ДДП или циклоплатамом in vitro, а также в образцах ДНК, выделенных из клеток E.coli после инкубации с этими препаратами. В опытах in vitro ДНК (0,1 мг/мл в 6,3 мМ калий-фосфатном буфере с 0,15 мМ NaCl, pH 7,2) инкубировали при 50њС с растворами различных концентраций ДДП или циклоплатама (от 5 до 240 мин). ДНК из E.coli выделяли по методу Мармура [10]. Сшивки определяли методом спектрофлюориметрии с этидий бромидом [11]. ДДП и циклоплатам были получены из лаборатории химико-фармацевтического анализа Онкологического научного центра РАМН.

Результаты и обсуждение

В опытах in vitro на препаратах ДНК тимуса теленка и E.coli впервые установлена способность циклоплатама вызывать зависимое от концентрации и времени инкубации образование значительного количества межнитевых сшивок.

Циклоплатам после инкубации с ДНК тимуса теленка в течение 1 ч индуцировал меньшее количество межнитевых сшивок, чем ДДП, при концентрации до 1 мМ (рис. 1). Отмечены некоторые различия в кинетике взаимодействия ДНК с циклоплатамом и ДДП, взятых в эквимолярных концентрациях. ДДП вызывает образование максимального количества сшивок уже через 2 ч, а циклоплатам - более чем через 4 ч (рис. 2, кривые 1, 3). Следует иметь в виду, что эквитоксические (терапевтические) дозы ДДП и циклоплатама различаются примерно в 7 раз. В эквитоксических концентрациях циклоплатам индуцирует большее количество сшивок, чем ДДП: через 1 ч инкубации 26 и 12%, а через 3 ч - 66 и 47% соответственно (рис. 2, кривые 1 и 2). Аналогичные результаты получены при инкубации препарата ДНК E.coli с ДДП и циклоплатамом.

Рис. 1. Зависимость образования межнитевых сшивок в ДНК тимуса теленка от концентрации ДДП (1) и циклоплатама (2) после инкубации в течение 1 ч.
По оси абсцисс - концентрация препаратов, мМ; по оси ординат - % сшивок.
Рис. 2. Кинетика образования межнитевых сшивок в ДНК тимуса теленка при обработке циклоплатамом в концентрации 0,35 мМ (1); ДДП - 0,05 мМ (2) или 0,35 мМ (3).
По оси абсцисс - время инкубации, мин; по оси ординат - % сшивок.

Циклоплатам так же как и ДДП, но в более высоких концентрациях, подавляет колониеобразующую способность клеток E.coli АВ1157 и АВ1886 (рис. 3). Дефектный по эксцизионной репарации штамм E.coli АВ1886 оказался существенно более чувствительным к воздействию циклоплатама по сравнению с диким штаммом АВ1157 (рис. 3, кривые 1, 2). В опытах с ДДП эти различия практически отсутствуют (рис. 3, кривые 3, 4).

Рис. 3. Влияние циклоплатама и ДДП на колониеобразующую способность клеток E.coli (a - время инкубации 30 мин; б, в - время инкубации 2 ч).
По оси абсцисс - концентрация препаратов, мМ; по оси ординат - колониеобразующая способность, % к контролю. Кривые 1 - циклоплатам, штамм АВ1157, 2 - циклоплатам, штамм АВ1886, 3 - ДДП, штамм АВ1157, 4 - ДДП, штамм АВ1886.

При инкубации клеток E.coli обоих штаммов в течение 30 и 120 мин с циклоплатамом и ДДП (интервал концентраций 10-350 мкМ) межнитевые сшивки были обнаружены только после инкубации клеток E.coli АВ1157 с ДДП в течение 120 мин: при концентрации ДДП, равной 10 мкМ, процент сшивок составил 10,4%, при 50 мкМ - 20,03%.

Анализ кривых на рис. 4 показывает, что оба изученных препарата индуцировали экспрессию гена sfiA - составной части SOS-регулона - в E.coli PQ37 sfiA::lacZ. При этом максимальная индуцирующая активность ДДП соответствовала концентрации индуктора 25 мкМ, при более высоких концентрациях экспрессия снижалась, по-видимому, вследствие токсичности соединения. В экспериментах с менее токсичным циклоплатамом зарегистрировано увеличение экспрессии гена sfiA с ростом концентрации препарата, однако максимальную индуцирующую концентрацию в пределах изученных установить не удалось. Это прямо подтверждают и количественные показатели SOS-индуцирующего потенциала - SOSIP для обоих соединений: он в 20 раз выше у ДДП, чем у циклоплатама: 60x10-5 нМ и 31,2x10-6 нМ, соответственно.

Рис 4. Экспрессия гена sfiA (SOS-ответ) в E.coli PQ37 sfiA::lacZ при действии циклоплатама (1) и ДДП (2).
По оси абсцисс - концентрация препаратов, мкМ; по оси ординат - активность бета-галактозидазы, ед.

Целью работы было получение информации о молекулярных механизмах чувствительности клеток некоторых штаммов E.coli к токсическому действию противоопухолевых препаратов циклоплатама и ДДП.

Нами впервые установлено, что циклоплатам в бактериальных клетках приблизительно в 10 раз менее токсичен, чем ДДП, независимо от состояния аллеля uvrA (см. рис. 3). Что же касается ДДП, то полученные нами результаты согласуются с данными Сэйлиса с соавторами [12], согласно которым устойчивость клеток к ДДП модифицировалась лишь незначительно - трехкратно - введением в геном мутации uvrA6, исключающей начальный этап эксцизионной репарации нуклеотидов. В отличие от ДДП, циклоплатам был в 20 раз более токсичен в отношении клеток репарационно-дефектного штамма по сравнению с диким (см. рис. 3), что свидетельствует о значительно большем вкладе системы эксцизионной репарации нуклеотидов в сохранение жизнеспособности клеток, обработанных циклоплатамом, в сравнении с ДДП.

Наряду с системой эксцизионной репарации нуклеотидов, устойчивость клеток E.coli к ДДП контролируется экспрессией recA-зависимых генов и активностью соответствующих продуктов - RecA-рекомбиназы (рекомбинационная репарация ДНК) и копротеазы (репарации в обход повреждений - SOS-репарация) [12]. Таким образом, мутационные изменения в генетическом контроле каждой из указанных систем репарации могут приводить к снижению резистентности клеток к препаратам.

В наших экспериментах с E.coli PQ37 sfiA::lacZ зарегистрирована экспрессия гена sfiA SOS-регулона при воздействии обоих препаратов, хотя их эффективность в этом процессе явно различна: SOSIP для ДДП был в 20 раз выше, чем у циклоплатама (см. рис. 4).

В связи с этими результатами можно предположить, что отсутствие полной перекрестной резистентности между ДДП и циклоплатамом в опытах с экспериментальными животными-опухоленосителями [3, 4] частично обусловлено различиями в системах репарации повреждений ДНК, индуцированных этими препаратами.

Среди различных аддуктов Pt-ДНК вклад доминирующих внутринитевых сшивок ДНК в общую токсичность, равно как и минорных межнитевых сшивок, пока не доказан. О роли межнитевых сшивок ДНК в реализации цитотоксичности в клетках про- и эукариот имеется противоречивая информация [13]. Экспериментально доказано, что именно остановка репликации ДНК приводит к индукции SOS-репарационного процесса в E.coli. Этот процесс зарегистрирован нами в модельной системе с E.coli PQ37, содержащей ген uvrA6, при воздействии обоих препаратов (см. рис. 4). Тем не менее ни один из препаратов не вызывал образования межнитевых сшивок ДНК в E.coli АВ1886 uvrA6, родственном E.coli PQ37. Следовательно, остановка репликации ДНК, запускающая SOS-индукцию в E.coli, не обусловлена, по-видимому, межнитевыми сшивками ДНК, а определяется другими структурными изменениями ДНК (внутринитевые сшивки, моноаддукты и др.).

В опытах с препаратами очищенной ДНК, инкубированными с циклоплатамом и ДДП, нам удалось определить достаточно высокое количество межнитевых сшивок (см. рис. 1, 2), что, вероятно, не определяет цитотоксичности этих препаратов в условиях in vivo. Имеются указания на существование различий в реакционной способности ДДП в изолированных препаратах ДНК и в клетках эукариот независимо от системы эксцизионной репарации [14]. Причины этих различий в настоящее время не ясны.

В условиях in vivo в реализацию цитотоксичности производных ДДП могут вовлекаться и совершенно другие механизмы. В частности, известно, что в опухолевых клетках, резистентных к ДДП и циклоплатаму, отмечается повышенный уровень восстановленного глутатиона и глутатион-зависимых ферментов [15].

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N4, стр. 9-12.

ЛИТЕРАТУРА

1. Canatta R., Rozencweig M., Wittes R.F. Cancer chemotherapy: сhallenges for the future/Kimura K., Yamada K., Carter S.K., Griswold D.P. eds. Tokyo 1990; 318-323.

2. Коновалова А.Л., Чельцов П.А., Кравченко А.П., Щелоков М.А. Докл АН СССР 1987; 294: 726-730.

3. Presnov M.A., Lonovalova A.L. Cycloplatam and oxoplatin - the new antitumour platinum compounds of the second generation. Arch Geschwulstforsch 1988; 1: 43-49.

4. Dress M., Dengler W.M., Hendriks H.R. et al. Cycloplatam: а novel platinum compound exibiting a different spectrum of antitumor activity to cisplatin. Eur J Cancer 1995; 31A: 356-361.

5. Fichtinger-Schepman A.M.J., van der Veer J.L. der Harlog J.H.J. et al. Adducts of the antitumor drug cis-diammine dichloroplatinum (II) with DNA: formation, identification and quatitation. Biochemistry 1985; 24: 707-713.

6. Howle J.A., Galle G.R. Cis-diammine dichloroplatinum (II) persistant and selective inhibition of deoxyribonucleic acid synthesis in vivo. Biochem Pharmacol 1970; 19: 2757-2762.

7. Comess K.M., Burstyn J.N., Essigmann J.M., Lippard S.J. Replication inhibition and translacion synthesis on templates containing site-specifically placed cis-DDP DNA adducts. Biochemistry 1992; 31: 3975-3990.

8. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М 1976.

9. Quillardet P., Huisman O., D'Ari R., Hofnung M. The Sos chromotest, a direct assay of induction in E.coli K12 to measure genotoxicity. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79: 5971-5975.

10. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J Mol Biol 1961; 3: 208-218.

11. Brent T.P. Suppression of cross-link formation in cloroethylnitrosourea-treated DNA by an activity in extracts of human leukemic lymphoblasts. Cancer Res 1984; 44: 1887-1892.

12. Salles B., Calsou P., Bouaydi K., Vinial H. Multiple mechanisms of resistance to cisplatin toxicity in an Escherichia coli K12 mutant. Toxicology 1994; 235-247.

13. Sanderson B.J.S., Ferguson L.R., Denny W.A. Mutagenic and cancerogenic properties of platinum - based anticancer drugs. Mutat Res 1996; 355: 59-70.

14. Bubley G.J., Teicher B.A., Ogeta G.K. et al. Differences in in vivo and in vitro sequence-specific sites of cisplatin-DNA adduct formation and detection of a dose - response relationship. Biochem Pharmacol 1994; 48: 145-153.

15. Дедерер Л.Ю., Ланкин В.З., Коновалова А.Л., Горбачева Л.Б. Исследования биохимических механизмов резистентности к новому противоопухолевому препарату аммин (циклопентиламин)-S(-) малатоплатина (II) (циклоплатам). Биохимия 1995; 60: 4: 602-610.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования