Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посмотрите новые поступления ... Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Цитотоксичность мевалоната, ловастатина и карминомицина в отношении человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4 in vitro

Леонтьева О.В., Тренин А.С., Бухман В.М., Дудник Ю.В.

Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков РАМН, Москва

В начало...


Показано, что ловастатин, ингибитор гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазы, в высоких концентрациях подавляет рост in vitro опухолевых клеток человека линии MOLT-4. Активность ловастатина в концентрациях 50-250 мкМ носит дозозависимый характер. Добавление к среде мевалоната в концентрации 3 мМ полностью снимает цитотоксическое действие 100 мкМ ловастатина. Вместе с тем экзогенный мевалонат не снижает цитотоксичность антрациклинового антибиотика карминомицина, а в высоких концентрациях (7 мМ) заметно подавляет рост опухолевых клеток и этот эффект суммируется с цитотоксическим действием низких концентраций карминомицина (0,08-0,175 мкг/мл). Полученные результаты, а также данные литературы свидетельствуют, что комбинация мевалоната, ингибиторов гидроксиметилглутарил-КоА-редуктазы и антрациклинов может быть полезна в химиотерапии опухолей. Это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.

Ключевые слова:

ловастатин, мевалонат, карминомицин, цитотоксичность, MOLT-4.

В последние годы большое внимание исследователей привлекает изучение роли продуктов метаболического пути мевалоната (стеринов и нестеринов) [8] для пролиферации различных клеток как нормальных, так и малигнизированных [4, 36].

Хотя механизмы участия продуктов мевалонатного пути в регуляции пролиферации клеток еще не расшифрованы, важнейшее значение, по-видимому, имеет облегчающий встраивание в мембраны процесс посттрансляционной модификации (фарнезиловая изопрениляция) росторегулирующих белков, таких как р21ras [31, 34], кодируемых ras протоонкогенами, что необходимо для проявления их биологической активности. К белкам такого типа относятся также гетеротримерные G-протеины [23, 39]. Участие продуктов мевалонатного пути в синтезе рецепторов для инсулиноподобного ростового фактора 1 существенно для роста ряда малигнизированных клеток [5].

Получены также доказательства определенной зависимости ростового потенциала клеток от способности синтезировать и удерживать в клетке эфиры холестерина [9].

Среди ингибиторов ферментов мевалонатного метаболического пути особое значение имеют статины [45], конкурентные, необратимые ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). Одним из наиболее изученных представителей этой группы является ловастатин. Продемонстрирована возможность угнетения статинами различных клеток, растущих in vitro [7, 14, 16, 17, 19, 26, 35, 37, 38, 40, 43, 44, 47], в том числе опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, опосредованной Р-гликопротеином [10]. Одновременно с угнетением пролиферации клеток нарушается их способность мигрировать [7, 18, 35]. Угнетение статинами пролиферации клеток может индуцировать их дифференцировку [26, 38]. Показано также подавление роста опухолей in vivo [20, 24, 35, 39] и угнетение химического канцерогенеза [31].

Ловастатин и другие препараты этой группы (симвастатин, правастатин) широко применяются в клинике для профилактики и лечения ишемической болезни сердца у больных с гиперхолестеринемией [1-3]. В процессе клинического использования выявилось, что важным побочным эффектом этих препаратов являются миодистрофии, в механизме развития которых существенная роль, по-видимому, принадлежит цитотоксическому действию этих препаратов на мышечные клетки [7, 11, 12, 22, 25, 37, 46]. С другой стороны, угнетение роста гладкомышечной подложки атеросклеротической бляшки служит, по-видимому, наряду с угнетением синтеза холестерина, одним из важных механизмов их лечебного действия [7, 25].

В настоящее время ловастатин в США испытывается в клинике в качестве противоопухолевого препарата. Ниже мы приводим данные изучения действия in vitro ловастатина и антрациклинового антибиотика карминомицина в отношении человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4 и влияния экзогенной мевалоновой кислоты на цитотоксичность этих препаратов.

Материал и методы

Препараты. Мевалоновую кислоту (С6Н10О3; Мв = 130,1) получали непосредственно перед использованием в опыте путем инкубации лактона мевалоновой кислоты (DL-$\beta$-гидрокси-$\beta$-метил-$\delta$-валеролактон, М 9627, "Sigma", США) в щелочи (2М лактон в водном растворе 0,02н. NaOH при температуре 40њС в течение 2-х ч). Использовали ловастатин производства фирмы "Merck Sharp & Dohme", США (L-154). Для приготовления растворов использовали этиловый спирт. Карминомицин (НИИНА РАМН) растворяли в среде инкубации.

Клетки и условия культивирования. Культуру злокачественных человеческих Т-лимфобластов MOLT-4 [29] поддерживали пассажами в 50-мл. стеклянных флаконах в среде RPMI-1640 с глутамином (1%), в присутствии сыворотки крупного рогатого скота (10%) и гентамицина (80 мг/л) при 37њС, в увлажненной атмосфере 5% СО2. В опытах клетки помещали в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций (Ленмедполимер) в количестве 2x104 клеток на лунку. В этих условиях клетки росли экспоненциально в течение 5 суток.

Изучение действия препаратов проводили, добавляя их в соответствующем разведении к суспензии клеток MOLT-4 после 20-24-часовой инкубации в планшетах. Конечный объем проб составлял 100 мкл. Инкубацию с препаратами проводили в увлажненной атмосфере 5% СО2 при 37њС в течение двух суток.

Выживаемость клеток MOLT-4 определяли с помощью МТТ-теста [6, 42]. Для этого по окончании инкубации в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий) (2,5 мг/мл в растворе PBS [150 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,2, 150 мМ NaCl], профильтрованном через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,3 мкм). После выдерживания в течение 4 ч при 37њС в увлажненной атмосфере 5% СО2 жидкость удаляли, вносили по 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и, встряхивая планшеты при комнатной температуре в течение 20 мин, растворяли образовавшиеся соли формазана. Развитие окраски регистрировали путем измерения оптической плотности при длине волны 540 нм непосредственно в лунках планшета с помощью сканирующего оптического микропроцессорного компаратора КОМП-1 "Linkey" (Россия).

Все эксперименты ставили не менее чем в 3-х повторностях. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statgraf. За достоверные принимали различия средних величин по t-критерию Стьюдента при р<0,05.

Результаты и обсуждение

При постановке МТТ-теста в специальных предварительных экспериментах (рисунок) была продемонстрирована практически прямая зависимость между числом клеток в интервале от 10000 до 80000 клеток и оптической плотностью. Это позволило в последующих опытах судить о динамике числа клеток по оптической плотности.

Рисунок. Зависимость оптической плотности в МТТ-тесте от числа клеток MOLT-4.

В связи с тем, что для растворения ловастатина использовали этиловый спирт, предварительно оценили чувствительность клеток MOLT-4 к указанному растворителю. Полученные при этом результаты (данные не показаны) свидетельствуют об относительной устойчивости культуры к этанолу, не проявлявшему заметного цитотоксического действия, включая концентрацию, равную 2%, которая была выбрана в качестве основной при проведении дальнейших экспериментов с ловастатином. Соответствующее количество этанола вносили в контрольные пробы, не содержавшие ловастатина. Испытание действия ловастатина на клетки MOLT-4 проводили в диапазоне концентраций препарата от 0,08 до 100 мкг/мл (0,2-250 мкМ). Как следует из результатов, представленных в табл. 1, подавление роста клеток MOLT-4 происходит при использовании ловастатина в концентрации 20 мкг/мл (50 мкМ) и выше, что позволяет сделать вывод о наличии у изучаемого препарата заметного цитотоксического действия в отношении клеток используемой линии.

Таблица 1. Влияние ловастатина на рост человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4
N опыта Kонцентрация ловастатина, мкг/мл (мкМ) Оптическая плотность (Ср. ст. откл.) Подавление роста (в % к контролю)
1 0 1,48 0,12 0
0,08 (0,2) 1,39 0,05 6
0,16 (0,4) 1,47 0,09 1
0,32 (0,8) 1,35 0,26 9
0,64 (1,6) 1,71* 0,02 -16
1,25 (3,1) 1,60 0,03 -8
2,5 (6,2) 1,64* 0,11 -11
5 (12,5) 1,31 0,23 11
10 (25) 1,29 0,47 13
20 (50) 0,94* 0,36 36
40 (100) 1,09* 0,10 26
2 0 0,86 0,11 0
5 (12,5) 0,77 0,03 10
10 (25) 0,73 0,14 15
20 (50) 0,67* 0,11 22
40 (100) 0,56* 0,17 35
3 0 1,17 0,20 0
5 (12,5) 1,16 0,16 0
10 (25) 1,01 0,15 14
20 (50) 0,78* 0,09 33
40 (100) 0,73* 0,07 38
4 0 1,12 0,24 0
20 (50) 0,74* 0,17 34
40 (100) 0,67* 0,12 40
80 (200) 0,61* 0,15 46
5 0 1,07 0,32 0
20 (50) 0,74* 0,15 31
40 (100) 0,65* 0,10 39
80 (200) 0,48* 0,14 55
6 0 1,15 0,38 0
20 (50) 0,81* 0,13 30
40 (100) 0,70* 0,14 39
80 (200) 0,46* 0,13 60
100 (250) 0,20* 0,13 83
Примечание: * - достоверное отличие от контроля.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования