Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Зарегистрируйтесь на нашем сервере и Вы сможете писать комментарии к сообщениям Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Изменение свойств плазматической мембраны Acholeplasma laidlawii при действии тетрациклина

Абрамычева Н.Ю., Вахрушева Т.В., Говорун В.М.

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ, Москва

В начало...


Проведено изучение роли физико-химических перестроек в плазмалемме клеток Acholeplasma laidlawii в формировании резистентности к тетрациклину. Показано, что клетки A.laidlawii обладают толерантностью к действию тетрациклина, сохраняя достаточно высокий титр клеток даже при концентрации антибиотика в среде инкубации, значительно большей МПК. Анализ результатов исследования структурных перестроек в плазматической мембране клеток, растущих в присутствии тетрациклина, выявил изменения текучести липидов в поверхностном слое, увеличение содержания холестерина и фосфолипидов. Величина наблюдаемых изменений зависела от времени введения тетрациклина в среду инкубации и от фазы роста культуры.

Ключевые слова:

Acholeplasma laidlawii, тетрациклин, адаптация, плазматическая мембрана, текучесть липидов, холестерин, фосфолипиды.

В последние годы наблюдается повышенный интерес к микроорганизмам класса Mollicutes. Молликуты (микоплазмы) - паразитические бактерии, лишенные клеточной стенки и способности синтезировать элементы пептидогликана, естественной средой обитания которых являются животные и высшие растения. Многие из этих бактерий патогенны [1].

Интенсивные исследования позволили выяснить роль гиперизменчивости некоторых факторов патогенности в развитии инфекционного процесса, вызванного молликутами. Обладая минимальным количеством генетической информации, необходимой для автономного самовоспроизведения, микоплазмы вместе с тем характеризуются чрезвычайно пластичным метаболизмом, позволяющим им ускользать от иммунологической защиты макроорганизма - хозяина и вызывать хронические персистирующие, нередко, системные заболевания [2].

Хорошо известна резистентность микоплазм in vivo ко многим группам антибиотиков, применяемым в клинике. В настоящее время тетрациклин и его производные являются антибиотиками выбора при лечении микоплазмозов, однако и они не всегда эффективны [3]. Так, в ряде случаев микоплазмы обнаруживают устойчивость к его высоким концентрациям, что связано, в основном, с хромосомными мутациями, нарушающими проникновение антибиотика в клетку, или с модификацией рибосом, обусловленной экспрессией гена TetM, находящегося в составе конъюгативного транспозона Tn 916 [4]. Следует особо отметить, что клиническое улучшение, наступающее после применения антибактериальных агентов, не сопровождается гибелью микоплазм, а обусловлено переходом острой формы инфекции в латентную, которая по истечении некоторого времени может вновь манифестировать [5].

При изучении механизмов, обеспечивающих формирование резистентности молликут к воздействию различных антибактериальных агентов, пристальное внимание уделяется детерминантам устойчивости, возникновению точечных мутаций, инактивирующих действие лекарства [6]. К настоящему времени исследований, посвященных изучению роли метаболической активности микоплазм в формировании резистентности к антибиотикам, в литературе нет.

По нашему мнению, метаболическая адаптация микоплазм является первым и одним из важнейших этапов формирования резистентности к воздействию антибактериальных агентов и, следовательно, нуждается в пристальном изучении.

Acholeplasma laidlawii, вид микоплазм, принадлежащий к семейству Acholeplasmataceae, не нуждается в стеролах для роста и деления клеток. В последнее десятилетие появилось несколько гипотез относительно роли различных компонентов плазматической мембраны ахолеплазм в формировании бислоя, а также в процессах, приводящих к изменению структуры и функции плазматической мембраны микоплазм в целом. Некоторые из них имеют экспериментальное подтверждение [7]. Однако остается невыясненным вопрос об участии физико-химических перестроек мембраны в адаптационных процессах, происходящих с клетками молликут, при воздействии антибактериальных агентов.

Данная работа посвящена описанию адаптационных изменений, протекающих в плазмалемме клеток A.laidlawii при введении тетрациклина в среду культивирования.

Материал и методы

В работе использовали клетки A.laidlawii, штамм PG-8A. Культивирование клеток, получение клеточной биомассы и выделение мембран проводили как описано ранее [8].

Кинетику роста культуры клеток в жидкой среде оценивали по изменению оптической плотности при 640 нм.

Определение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) проводили как описано в [7].

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) для тетрациклина определяли культивированием клеток A.laidlawii в 96-луночном планшете с серией разведений антибиотика от 0,1 до 1 мкг/мл с шагом 0,05 мкг/мл в трех повторах. О росте культуры судили по изменению цвета фенолового красного при закислении среды культивирования в процессе жизнедеятельности микроорганизма.

Исследование изменений в структурной организации липидной фазы плазматической мембраны проводилось методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В качестве парамагнитного (спинового) зонда использовали 5-доксилстеариновую кислоту ("Sigma"). Для ЭПР-исследований клетки из культуральной жидкости концентрировали центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин, дважды промывая холодным раствором содержащим 50 мМ трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, осадок клеток ресуспендировали в том же растворе до концентрации белка 5 мг/мл. Для измерений в 100 мкл суспензии клеток вводили зонд в микроколичествах (0,5-1 мкл из концентрированного раствора (5 мМ) в этиловом спирте). Этанол в концентрации до 1% не влиял на спектры ЭПР. Запись спектров ЭПР проводилась на радиоспектрометре JES-FE2XG (JEOL, Япония), оснащенном приставкой для термостатирования образцов. Условия записи спектров: микроволновая мощность- 10 мВт; частота ВЧ-модуляции - 100 кГц; амплитуда ВЧ-модуляции - 1 и 4 Гс; скорость сканирования 6,25 Гс/мин; постоянная времени фильтра - 0,3 с; температура образца - 37њС. Из спектров ЭПР рассчитывали параметр упорядоченности S [9].

Общую фракцию липидов из мембран выделяли по методу, описанному в [10]. Количество фосфолипидов определяли по неорганическому фосфору [11], предварительно сжигая пробы с хлорной кислотой. Концентрацию холестерина определяли хроматографически на колонке Диасорб 200 С16Т 4x250 ("ЭЛСИКО", Россия) в режиме изократической элюции в системе ацетонитрил-изопропанол (60:40, об/об), при скорости элюирования 1 мл/мин. Детектирование осуществлялось по оптическому поглощению на проточном УФ-спектрофотометре при 210 нм. Концентрацию холестерина рассчитывали по площади пиков на хроматограмме, используя метод внешнего стандарта и программный пакет фирмы "Gilson" - GME714.

Экспериментальные данные представлены как средние величины M sn-1.

Результаты и обсуждение

Работа по изучению адаптационных процессов, протекающих в плазматической мембране под действием тетрациклина, была проведена на культуре клеток A.laidlawii. Морфология и структурная организация этого вида хорошо изучены. Вследствие преимущественно паразитического существования микоплазм жизнедеятельность этих микроорганизмов во многом зависит от условий внешней среды. Так, известно, что клетки A.laidlawii для нормального роста на искусственных питательных средах нуждаются в 12 аминокислотах, витаминах. Ахолеплазмы лишены ферментов биосинтеза ненасыщенных жирных кислот и используют экзогенные жирные кислоты, которые присутствуют в среде роста [12]. A.laidlawii не нуждается в холестерине для нормального роста и развития, однако присутствие стерола в питательной среде при культивировании этого вида увеличивает скорость роста и приводит к значительно более высокому титру клеток [13].

Полный цикл развития культуры клеток в жидкой среде, содержащей 6% сыворотки крупного рогатого скота, (рис. 1а, кривая 1) протекает за 15-17 ч, и включает следующие фазы роста: латентную (до 5 ч), логарифмическую (от 5 до 15 ч) и далее стационарную. Культивирование микоплазмы в присутствии тетрациклина в концентрации 0,25 мкг/мл, определенной нами как МПК для данного штамма ахолеплазм (рис. 1а, кривая 2), привело к увеличению латентной фазы (до 8-9 ч) и уменьшению максимальной оптической плотности культуры в два раза. При инкубации клеток A.laidlawii с тетрациклином в концентрации 2,5 мкг/мл, в 10 раз превышающей МПК, рост культуры, судя по изменениям оптической плотности, не наблюдался (рис. 1а, кривая 3). Однако, как следует из данных, представленных на рис. 1б, клетки A.laidlawii обладают толерантностью к действию тетрациклина, сохраняя жизнеспособность даже при концентрации антибиотика в среде инкубации, значительно большей МПК. Такая способность переносить неблагоприятные условия культивирования данным видом микроорганизмов указывает на существование механизма защиты, связанного, по-видимому, с изменениями плазмалеммы.

Рис. 1. Влияние тетрациклина на рост культуры A.laidlawii и структуру плазматической мембраны клеток в процессе культивирования.
а - оптическая плотность культуры; б - титр клеток (в lg КОЕ); в - параметр упорядоченности (S).
1 - инкубация без антибиотика (контроль), 2 - в присутствии 0,25 мкг/мл тетрациклина, 3 - в присутствии 2,5 мкг/мл тетрациклина.

О структурных перестройках в липидной фазе биологических мембран можно судить по изменению подвижности липидных зондов, включенных в мембрану. С этой целью мы использовали жирнокислотный спиновый зонд - 5-доксилстеариновую кислоту, который располагается в поверхностном слое биомембран аналогично эндогенным жирным кислотам. Одной из характеристик, оценивающих движение жирнокислотных спиновых зондов, является параметр упорядоченности S. Увеличение его значения связано с возрастанием упорядоченности окружающих зонд липидных молекул, а следовательно, и уменьшением текучести биомембран.

На рис. 1в, представлены результаты по определению параметра S для 5-доксилстеариновой кислоты в клетках, отобранных в разные моменты времени из культур, растущих в присутствии тетрациклина и без него. Из приведенных данных следует, что после внесения инокулята в свежую среду наблюдается резкое уменьшение параметра S. Далее для контрольных клеток, т.е. клеток, развивающихся в отсутствие антибиотика, низкое значение S сохранялось почти до середины логарифмической фазы, а затем начинало расти, достигая максимальных величин в стационарной фазе. Введение тетрациклина в среду культивирования в концентрации 0,25 мкг/мл привело к сокращению времени, в течение которого S оставалось на уровне низких значений. В этом случае уже к концу латентной фазы параметр S несколько возрастал, оставаясь в дальнейшем постоянным на протяжении всего жизненного цикла культуры в жидкой среде. Тетрациклин в высокой концентрации (2,5 мкг/мл), наоборот, увеличивал время, в течение которого сохранялись низкие значения S. Из анализа полученных данных следует, что текучесть липидов в поверхностном слое (на глубине ~0,6 нм) плазмалеммы клеток, инкубируемых с высокой концентрацией тетрациклина, остается длительное время аналогичной текучести липидов мембраны клеток контрольной культуры, находящейся в латентной фазе. Значения показателя микровязкости плазмалеммы ахолеплазм, растущих в присутствии МПК тетрациклина, после небольшого уменьшения в начале латентной фазы, на протяжении всего дальнейшего цикла развития соответствует текучести липидов мембраны контрольных клеток, находящихся в середине логарифмической фазы.

Молекулярная организация липидов, их упорядоченность в мембранном бислое зависит от размеров и заряда головной группы фосфолипидов; длины и степени ненасыщенности ацильных цепей; содержания холестерина; температуры; рН и т.д. Известна биологическая роль холестерина, входящего в состав мембраны, как стабилизатора ее текучести [14]. Одним из объяснений наблюдаемых нами колебаний показателя микровязкости мембраны под действием тетрациклина может быть изменение содержания холестерина в плазмалемме культуры клеток A.laidlawii, инкубируемой в присутствии тетрациклина (рис. 2). На этом этапе мы вносили тетрациклин в среду инкубации в различные фазы роста (рис. 2а). Анализируя кривые роста, можно предположить, что добавление антибиотика к культуре клеток в период активного деления (середина логарифмической фазы, кривая 4) приводит к полному торможению развития культуры клеток ахолеплазм. Введение же тетрациклина в среду культивирования одновременно с инокулятом (кривая 2) или на ранней стадии развития (начало логарифмической фазы, кривая 3) не является столь драматичным, судя по данному параметру (А640), что указывает на большую степень адаптации клеток микоплазм к присутствию антибиотика, при появлении его на ранних фазах роста.

Рис. 2. Зависимость роста культуры клеток A.laidlawii (а), содержания холестерина (ХС) в мембранах (б) и холестерин/фосфолипидного (ХС/ФЛ) индекса (в) от времени внесения тетрациклина (0,25 мкг/мл) в среду инкубирования.
1 - контроль; 2 - тетрациклин внесен в нулевой момент времени; 3 - тетрациклин внесен в начале логарифмической фазы; 4 - тетрациклин внесен в середине логарифмической фазы.

Количественное содержание холестерина в плазмалемме может указывать на физиологическое состояние культуры клеток. Так, например, известно, что клетки A.laidlawii накапливают холестерин в мембране при старении культуры [15] или при адаптации ее к токсическим соединениям [7]. В наших экспериментах мы также наблюдали увеличение содержания холестерина в процессе роста контрольной культуры клеток (рис. 2б, кривая 1). Внесение антибиотика в среду культивирования приводило к увеличению содержания холестерина (в расчете на 1 мг клеточного белка), в некоторых случаях в два раза по сравнению с контролем. Обращает на себя внимание несколько отличное развитие культуры, инкубируемой с тетрациклином с момента посева (рис. 2б, кривая 2). Наблюдаемое снижение содержания холестерина в мембране на 9-11 ч культивирования в присутствии тетрациклина соответствует аналогичному понижению для контрольной культуры (кривая 1) в области 5-6 ч и связано, по-видимому, с увеличением латентной фазы в случае внесения тетрациклина в среду инкубирования одновременно с посевом. В целом же содержание холестерина в клетках, растущих в присутствии тетрациклина, значительно выше его содержания в клетках контрольной культуры на всех фазах роста. Однако наблюдаемое понижение содержания холестерина в начале логарифмической фазы в клетках культуры, развивающейся в присутствии тетрациклина, позволяет предположить, что при такой постановке эксперимента адаптация к тетрациклину связана не только с повышением содержания холестерина в плазмалемме. Физико-химические свойства мембраны, а также фазовые переходы липидов мембран определяются соотношением основных составляющих липидных бислоев, среди которых важное место занимают фосфолипиды. Из литературы известно, что содержание фосфолипидов в мембране A.laidlawii величина стабильная на протяжении всего жизненного цикла [16]. В наших экспериментах мы также наблюдали, что содержание фосфолипидов в клетках контрольной культуры не менялось в процессе роста и составляло 0,12-0,14 мкмоль/мг белка. Введение же тетрациклина в среду инкубирования привело к увеличению содержания фосфолипидов в 1,5-2 раза в логарифмической фазе. В связи с этим холестерин/фосфолипидный индекс клеток A.laidlawii (рис. 2в) в период активного роста (логарифмическая фаза) в присутствии тетрациклина (кривая 2) не превышает аналогичный индекс клеток контрольной культуры (кривая 1).

Приведенные экспериментальные данные позволяют заключить, что клетки A.laidlawii способны переносить высокие концентрации тетрациклина, сохраняя при этом свою жизнеспособность, и даже могут делиться при критических концентрациях антибиотика. Такие адаптационные свойства данного вида микроорганизмов связаны, по-видимому, с их высокой полиморфностью и гетерогенностью, что в свою очередь обусловлено существованием механизмов, позволяющих быстро корректировать липидный состав плазматической мембраны в ответ на изменяющиеся внешние и внутренние условия жизнедеятельности, тем самым сохраняя целостность клетки.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N2, стр. 8-12.

ЛИТЕРАТУРА

1. McCoy E., Basham H.G., Tully J.G. et al. Int J Syst Bacteriol 1984; 34: 11-15.

2. Kenny G.E., Cartwright F.D. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 11: 2628-2632.

3. Cummings M.C., McCormack W.M. Ibid 1990; 34: 2297-2299.

4. Roberts M.C., Koutsky L.A., Holmes K.K., LeBlanc D.J. Ibid 1985; 28: 141-143.

5. Cunnings M.C., McCormack W.M. Ibid 1990; 34: 2297-2299.

6. Roberts M.C., Kenny G.E. Ibid 1986; 29: 350-352.

7. Говорун В.М., Бондарева Е.В., Кулакова С.Н., Капитанов А.Б. Микробиология 1993; 62: 70-75.

8. Kapitanov A.B., Ivanova V.F., Ladygina V.G. Mech Ageing Dev 1990; 55: 161-169.

9. Gaffney B.J., McConnel H.M. J Magn Res 1974; 16: 1-28.

10. Vercaemst R., Union A., Rosseneu M. J Chromatogr 1989; 494: 43-52.

11. Bartlett G.R. J Biol Chem 1959; 234: 466-469.

12. Razin S., Glaser G., Amikam D. Ann Microbiol 1984; 135: 9-15.

13. Rottem S. Rev Infect Dis 1982; 4: 597-598.

14. Wu S.H.W., McConnell H.M. Biochemistry 1974; 14: 847-850.

15. Капитанов А.Б., Ладыгина В.Г., Муханкина А.И. и др. Биохимия 1983; 48: 1921-1926.

16. Rasin S., Kutner S., Efrati H., Rottem S. Biochim Biophis Acta 1980; 598: 628-640.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования