Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Биология | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Влияние аэрации и окислительно-восстановительного потенциала на биосинтез противогрибкового антибиотика имбрицина

Сухаревич М.Э., Яковлева Е.П., Борисова О.Г., Сухаревич В.И.

Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

В начало...


Изучена зависимость между процессом биосинтеза антибиотика имбрицина культурой Streptomyces imbricatus и уровнями аэрации и редокс-потенциала среды (Eh). Показано, что в исследуемых интервалах скоростей растворения кислорода - от 2,9 до 0,5 г О2/лћч - наибольший выход антибиотика наблюдается при максимальной скорости. На фоне интенсивной аэрации (2,9 г О2/лћч) снижение Eh с помощью восстановителей (аскорбиновая кислота, L-тирозин, K4Fe(CN)6) стимулирует процесс, а в вариантах с меньшей скоростью растворения кислорода - ингибирует. При недостаточной аэрации стимуляция процесса биосинтеза имбрицина возможна при повышении Eh среды с помощью окислителей (K2Cr2O7, K3Fe(CN)6, KMnO4). Таким образом, для интенсификации синтеза антибиотика необходима не только эффективная аэрация, но и определенный уровень редокс-потенциала ферментационной среды.

Ключевые слова:

имбрицин, биосинтез, окислительно-восстановительный потенциал, аэрация, Streptomyces imbricatus.

К числу важнейших условий, влияющих на жизнедеятельность аэробных микроорганизмов, относятся аэрация и связанный с ней комплексный фактор - окислительно-восстановительный потенциал (Eh). Известно, что между уровнем растворенного кислорода в среде и Eh существует линейная зависимость, в связи с чем редокс-потенциал оценивают и как показатель обеспеченности среды кислородом [1-4]. Более того, по мнению некоторых авторов, контроль за микробиологическими процессами по уровню Eh более предпочтителен, чем по рО2, определяемому с помощью мембранных датчиков Кларка [5]. Однако вопрос о роли редокс-потенциала в микробиологических процессах нельзя сводить только к проблеме контроля кислорода, так как информация, которую можно получить о процессе с использованием этого показателя, намного обширнее [1, 6, 7].

К настоящему времени с использованием микроорганизмов различных систематических групп накоплен обширный экспериментальный материал и опыт по направленной и эффективной регуляции процессов микробного синтеза с помощью Eh. Однако, по нашему мнению, наименее изученным остается вопрос о влиянии редокс-потенциала на процессы жизнедеятельности актиномицетов. В то же время из известных источников следует, что физиологическая активность этих бактерий в значительной степени зависит от уровня редокс-потенциала среды [8-12].

Так, на исключительно важную роль редокс-потенциала в процессах синтеза антибиотиков актиномицетами указывается в работах [10-13], выполненных с продуцентами противогрибковых полиеновых антибиотиков леворина и микогептина. В этих исследованиях сделана попытка разграничить и оценить действие каждого из факторов - аэрации и редокс-потенциала среды на процессы антибиотикообразования и роста продуцентов.

Авторы этих исследований показали, что, регулируя только уровень Eh среды окислителями и восстановителями при прочих равных условиях, возможно влиять на прирост биомассы продуцентов, на количество образующихся антибиотических комплексов, на соотношение отдельных компонентов (леворина А и леворина В, гептаена и пентаена в микогептине), входящих в их состав.

В настоящей работе представлены результаты исследования действия аэрации и редокс-потенциала среды на процесс биосинтеза неполиенового противогрибкового антибиотика имбрицина культурой Streptomyces imbricatus.

Материал и методы

В работе использовали продуцент имбрицина Streptomyces imbricatus ЛИА-0112 [14].

Культивирование проводили в колбах емкостью 750 мл на средах следующего состава (в г/л): глюкоза - 50; кукурузная мука - 40; соевая мука - 20; углекислый кальций - 1; рН после стерилизации - 6,6-6,8. Продолжительность ферментации на качалке (n = 200 мин-1) при 27њС составляла 72-168 ч в зависимости от цели опыта.

Антибиотическую активность в культуральной жидкости определяли спектрофотометрически. Антибиотик из культуральной жидкости экстрагировали 65% водным раствором изопропанола в течение 1 ч при встряхивании. Затем пробу отфильтровывали, фильтрат разводили 96% этиловым спиртом и на СФ-46 определяли оптическую плотность этого раствора при 240 и 270 нм. Содержание имбрицина рассчитывали по формуле: А = [(D240 - D270)ћ67,5ћP1ћP2]/n, где А - содержание имбрицина в культуральной жидкости (мкг/мл); D240 и D270 - оптические плотности раствора; Р1 и Р2 - разведение пробы при экстракции и разведении экстракта соответственно; n - объем культуральной жидкости, взятой для анализа; 67,5 - расчетный коэффициент пропорциональности спектрофотометрического и биологического методов анализа.

Измерение окислительно-восстановительного потенциала (Eh) сред и культуральной жидкости проводили гладким платиновым электродом ЭПВ-1 и вспомогательным хлорсеребряным электродом ЭВЛ-1М3 на потенциометре рН-673 и выражали в мВ [15]. Проверку редокс-электродов вели по редокс-буферным растворам, представленным в ГОСТ 8.450-81 (Шкала окислительных потенциалов водных растворов).

Регуляцию уровней Eh ферментационной среды проводили с помощью различных окислителей (K3Fe(CN)6, K2Cr2O7, KMnO4) и восстановителей (аскорбиновая кислота, L-тирозин, K4Fe(CN)6).

Различные уровни аэрации создавали варьированием объема среды в колбах от 30 до 200 мл, скорость сорбции кислорода при используемом способе аэрации оценивали по сульфитному числу [16].

Результаты и обсуждение

Биосинтез имбрицина осуществляется на обогащенной, высококонцентрированной среде, а, следовательно, для интенсификации этого процесса обеспечение клеток продуцента кислородом приобретает особую важность.

С целью определения зависимости между синтезом имбрицина и интенсивностью аэрации среды культивирование продуцента проводили при различной аэрации: 2,9; 1,7; 0,7 и 0,5 г О2/лћч (по сульфитному числу).

Как следует из результатов, представленных на рис.1, наибольшее количество антибиотика образуется при максимальном из исследованных уровне аэрации 2,9 г О2/лћч. Снижение скорости растворения кислорода в культуральной жидкости сопровождается резким снижением выхода антибиотика, продолжительность процесса увеличивается.

Рис. 1. Динамика процесса биосинтеза имбрицина при культивировании продуцента в условиях, различающихся по интенсивности аэрации среды (г О2/лћч): 1 - 2,9; 2 - 1,7; 3 - 0,9; 4 - 0,7; 5 - 0,5.
По оси абсцисс - время культивирования, сут;
по оси ординат - концентрация имбрицина, мкг/мл.

В зависимости от интенсивности аэрации в среде создаются определенные различные уровни редокс-потенциала, и это различие сохраняется в течение всего процесса ферментации (рис. 2).

Рис. 2. Динамика изменения рН (А) и редокс-потенциала (Б) среды в процессе культивирования продуцента при различной интенсивности аэрации среды: 1 - 2,9; 2 - 1,7; 3 - 0,9; 4 - 0,7; 5 - 0,5 г О2/лћч.
По оси абсцисс - время, сут; по оси ординат - Eh (мВ), рН.

Таким образом, наблюдаемый эффект действия аэрации на биосинтез имбрицина (см. рис.1), может быть обусловлен двумя взаимосвязанными факторами, действующими одновременно: аэрацией и редокс-потенциалом.

Для оценки роли каждого из этих факторов в отдельности на биосинтез антибиотика эксперименты проводили при постоянных уровнях аэрации, но при различных значениях редокс-потенциала, создаваемых окислителями и восстановителями.

Как показали результаты этих исследований, действие всех используемых окислителей (восстановителей) на процесс антибиотикообразования однотипно и не зависит от их химической природы и, следовательно, обусловлено их воздействием на уровень редокс-потенциала среды. В связи с этим основная часть исследования выполнена с использованием в качестве регуляторов редокс-потенциала ферри- и ферроцианидов калия.

Как следует из данных, представленных в таблице, в условиях интенсивной аэрации и при высоком уровне редокс-потенциала, создаваемого кислородом воздуха (2,9 г О2/лћч), внесение окислителя в среду приводит к ингибированию биосинтеза имбрицина, в результате чего количество образуемого антибиотика снижается в среднем на 17%. При менее интенсивных уровнях аэрации и сравнительно низком редокс-потенциале окислители, напротив, стимулируют процесс. Так, при скорости растворения кислорода 1,7 г О2/лћч и повышенном до 480 мВ с помощью окислителя редокс-потенциале имбрицина образуется практически столько же, сколько при самой интенсивной аэрации - 2,9 г О2/лћч.

При более низких уровнях аэрации (0,9-0,5 г О2/лћч) повышение Eh окислителями так же стимулирует процесс синтеза антибиотика, но абсолютные значения конечных его концентраций остаются существенно ниже, что, по-видимому, обусловлено недостатком кислорода в этих условиях.

Принципиально иная зависимость наблюдалась при снижении редокс-потенциала среды восстановителями. Так, при наибольшей из исследуемых скоростей растворения кислорода (2,9 г О2/лћч) возможно с помощью восстановителей на 40% повысить концентрацию имбрицина в культуральной жидкости, в то время как при более низких скоростях растворения кислорода восстановители однозначно приводят к ингибированию процесса.

Учитывая, что на конечный результат любого микробиологического процесса оказывают влияние не только условия ферментации, но и условия выращивания посевного материала, нами были проведены эксперименты, в которых редокс-потенциал регулировали или только в посевной среде, или только в ферментационной, или дважды - в посевной и ферментационной. Культивирование проводили при трех уровнях аэрации - 2,9, 1,7 и 0,9 г О2/лћч. Как показали результаты (рис. 3), регуляция редокс-потенциала только посевной среды как окислителем, так и восстановителем практически не оказывает влияния на конечный результат процесса при различных уровнях аэрации.

Рис. 3. Влияние окислителя и восстановителя на биосинтез имбрицина при внесении их в среды на разных стадиях процесса культивирования продуцента.
А, Б, В - интенсивность аэрации среды 2,9; 1,7 и 0,9 г О2/лћч соответственно.
1 - внесение в посевную среду; 2 - в ферментационную среду; 3 - в посевную и ферментационную среды.
По оси ординат - образование имбрицина, % к контролю.
- окислитель K3Fe(CN)6 (0,1%);
- восстановитель K4Fe(CN)6 (0,1%).

Наибольший эффект как положительный, так и отрицательный достигается регуляцией Eh только в ферментационной среде. Однако в этом случае, как и в варианте с двукратным внесением регуляторов, знак эффекта определяется уровнем аэрации среды. При интенсивной аэрации окислители ингибируют, а восстановители стимулируют образование имбрицина. По мере снижения аэрации, напротив, увеличиваются положительный эффект от действия окислителей и ингибирующий - от действия восстановителей.

Таким образом, редокс-потенциал как фактор среды может быть использован для контроля за интенсивностью аэрации среды, направленно влиять на биосинтез имбрицина. Для активного синтеза имбрицина необходимо поддерживать в среде определенные уровни не только аэрации, но и редокс-потенциала.

Легко реализуемым способом регуляции редокс-потенциала питательных сред, а, следовательно, и биосинтеза имбрицина, является внесение в их состав окислителей или восстановителей.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N12, стр. 12-15.

ЛИТЕРАТУРА

1. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (рН и rН) в жизнедеятельности микроорганизмов. М 1957; 276.

2. Штоффер Л.Д., Миркин Л.Г. Приклад биохим 1969; 2: 151-157.

3. Pullen K.F. Develop Biol Standard 1985; 60: 175-177.

4. Thompson B.G., Gerson D.F. Biotechnol and Bioeng 1985; 27: 10: 1512-1515.

5. Dahod S.K. Biotechnol and Bioeng 1982; 24: 9: 2123-2125.

6. Кристансонс М.Ж., Хабибулин Р.Э. Процессы и аппараты микробиол производств. Обзор инф. Сер VII. М 1985; 1-31.

7. Brunger R. Radiat Environ Biophys 1982; 21: 2: 141-154.

8. Власов В.И. Антибиотики и химиотер 1996; 4: 23-29.

9. Кривова А.Ю., Егоров Н.С., Аль-Нури М.А. Приклад биохим 1977; 13: 23-25.

10. Сухаревич В.И., Швецова Н.Н., Яковлева Е.П. Антибиотики 1970; 11: 981-984.

11. Сухаревич В.И., Яковлева Е.П., Цыганов В.А., Швецова Н.Н. Микробиология 1970; 6: 981-985.

12. Сухаревич В.И., Яковлева Е.П., Швецова Н.Н., Медведева Н.Г. Антибиотики 1978; 10: 875-879.

13. Цыганов В.А., Сухаревич В.И., Яковлева Е.П. Там же 1969; 8: 702-706.

14. Цыганов В.А., Конев Ю.Е., Барашкова Н.П., Петрова Л.Д. Там же 1970; 3: 208-212.

15. Шульц М.М., Писаревский А.М., Полозова И.П. Окислительно-восстановительный потенциал. Л 1984; 113-119.

16. Pirt S.I., Callow D.S. J Appl Bacteriol 1958; 21: 2: 206.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования