Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Химиотерапия и антибиотики | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Современные пути поиска новых антибактериальных агентов: предложения и дискуссии

Сазыкин Ю.О.

Редакционные статьи

В начало...


Количество описанных к настоящему времени индивидуальных природных веществ с антимикробными свойствами приближается к двадцати тысячам. При его сопоставлении с количеством препаратов, применяемых в медицине, обычно указывается, что свыше 99% открываемых антибиотиков бракуется из-за их токсичности [1].

Это утверждение справедливо лишь отчасти. Изучение многих новых структур было прервано вследствие того, что они по спектру действия, активности, стоимости не могли выдержать конкуренцию с ранее внедренными в медицинскую практику антибиотиками. Однако в связи с постепенным снижением эффективности много лет применяемых препаратов положение изменилось. Кроме того, вторичные метаболиты микроорганизмов обнаруживаются, как правило, семействами, минорные компоненты которых не подвергались подробному биологическому изучению.

В связи с изложенным возникает целесообразность проведения тщательной переоценки групп антибиотиков, открытых в 60-70-е годы, механизм действия которых отличается от механизма действия веществ, применяемых в клинике, но теряющих эффективность из-за резистентности к ним сегодняшней микрофлоры. К таким семействам относятся: кирромицины, ланкацидины, плеуромутилины, стрептограмины, сидеромицины и т.д. [1]. Их продуценты сохраняются в коллекциях культур, схемы выделения и идентификации разработаны. Можно привести в качестве примера тот факт, что в 50-х годах один из сидеромицинов уже использовался в клинике, но не выдержал конкуренции с появившимися позднее полусинтетическими пенициллинами, эра которых наступила в начале 60-х годов.

Поиск аналогов антибиотиков, которые связываются с мишенями, претерпевшими модификацию в результате внедрения впрактику антибиотиков, открытых в 50-70-е годы

Такой путь традиционен [2]. Однако лишь к настоящему времени накоплены факты, демонстрирующие его перспективность. Так, новая генерация тетрациклинов - полусинтетические глицилциклины реагирует с рибосомами, потерявшими способность связывать природные тетрациклины [2-4].

Новые карбапенемы - L-695 и Sm-17466 реагируют с пенициллинсвязывающим белком (ПСБ) - ПСБ2' - продуктом, кодируемым mecA геном, т.е. подавляют функции ПСБ, заменяющего у грамотрицательных микробов все другие ПСБ. Тем самым в принципе показано, что могут быть получены новые беталактамные структуры, активные против метициллинорезистентных штаммов [5].

Синтез N-замещенных гликопептидов (и претерпевших другие модификации), не теряющих активности при потере ее ванкомицином и тейкопланином [6, 7], также показывает, что проблема резистентности к препаратам ванкомицина и тейкопланина может быть решена на этой основе.

Преодоление активности защитных ферментов

Наиболее успешно развивающееся направление поиска практически ценных аналогов старых антибиотических структур основано на знании молекулярных механизмов их ферментативной инактивации. Создание новых аналогов здесь может быть действительно целенаправленным. Именно так были получены изоксазолилпенициллины, цефалоспорины последних поколений, а из аминогликозидов - амикацин. Общеизвестны и успехи в получении ингибиторов бета-лактамаз.

Представляет большой интерес, но сталкивается со специфическими трудностями проблема создания избирательных ингибиторов аминогликозид-фосфо- и -аденилилтрансфераз. В данном случае активный центр фермента оперирует двумя субстратами - антибиотиком и АТФ. Попытки создать ингибиторы, включающие в свою структуру фрагменты обоих субстратов, привели к получению громоздких молекул, проявляющих некоторую ингибиторную активность в бесклеточных энзиматических системах, но слабо проникающих в клетку.

До настоящего времени не реализованы, но и не опровергнуты возможности создания ингибиторов многоступенчатого пути индукции защитных ферментов. Если структуры со слабой индуцирующей активностью выявлены (в рядах цефалоспоринов), то относительно специфических ингибиторов индукции, пригодных для комбинированной химиотерапии, сообщений нет.

Активный выброс антибиотиков из микробной клетки

Современный уровень знания механизмов антибиотикорезистентности ставит в порядок дня разработку еще одного подхода к ее преодолению. Все больше привлекают к себе внимание системы энергозависимого выброса антибиотиков (efflux pumps). Они рассматриваются как причина частых неудач антимикробной (и противоопухолевой) химиотерапии. Субстратами этих систем, локализованных в цитоплазматической мембране, являются представители по крайней мере трех из основных групп антимикробных агентов: тетрациклины, макролиды и фторхинолоны. Вполне логичным кажется поиск аналогов, не распознаваемых белком-ловушкой, составляющим часть систем активного выброса [2]. Доказательством реальности получения здесь положительных результатов является создание уже упоминавшихся глицилциклинов.

По некоторым наблюдениям, частота встречаемости резистентности именно за счет активного выброса растет быстрее, чем резистентность за счет других механизмов, и не исключено, что именно этот вид резистентности в будущем окажется превалирующим. Практически не изучен еще вопрос о возможности избирательного подавления активности систем энергозависимого выброса. Многокомпонентность каждой такой системы повышает обоснованность ожидания здесь успеха. Разумеется ингибиторы данной защитной системы должны будут применяться в комбинации с защищаемыми антибиотиками (по аналогии со слабо влияющими на существенные клеточные мишени ингибиторами бета-лактамаз). Примером реверсии к антибиотикочувствительному фенотипу под влиянием ингибиторов системы активного выброса могут служить данные о том, что циклоспорин А и некоторые его производные, лишенные иммуносупрессорной активности, способны возвращать опухолевым клеткам утраченную чувствительность к антрациклинам и другим противоопухолевым агентам.

Особенно важной проблемой представляется противодействие системе активного выброса в случае фторхинолонов. Это обусловлено как значением этого обширного и быстро растущего класса антимикробных агентов, так и тем обстоятельством, что их ферментативной инактивации в течение многих лет не наблюдалось. Исходя из особенностей мишени для фторхинолонов - построенной из димеров А и В субъединиц ДНК-гиразы, а также ее роли в "биологическом потенциале" клетки (прежде всего в скорости размножения), хинолонорезистентные именно на уровне мишени культуры, получаемые и изучаемые в лабораториях, могут не получить широкого распространения в природных условиях. Распространение резистентности к хинолонам на уровне оболочки микробной клетки может быть обусловлено - в случае грамотрицательных бактерий - сочетанием двух механизмов: изменением или слабой экспрессией отдельных компонентов внешней мембраны (пориновых белков, липополисахаридов) и наличием системы активного выброса в цитоплазматической мембране, а в случае грамположительных микроорганизмов - только последним механизмом [8].

Поскольку в настоящее время особое значение приобрело создание хинолоновых структур с повышенной активностью против грамположительных бактерий, параллельное получение ингибиторов систем активного выброса - или непосредственно реагирующих с ними в мембране, или предотвращающих их образование на уровне транскрипции, становится все более актуальной задачей.

Обсуждая возможности поиска новых мишеней в бактериальной клетке, которые расширили бы перспективы использования фторхинолонов, следует отметить, что комплекс ферментов, участвующих в превращениях ДНК, все еще мало изучен. Помимо ДНК-топоизомераз и, соответственно, бактериальной ДНК-гиразы, открытых относительно недавно, в репликации ДНК, в репарационных процессах, в контроле за клеточным циклом (у эукариот) принимают участие ДНК-геликазы, катализирующие раскручивание двунитевой ДНК в однонитевую матрицу, требующуюся для репликации ДНК и при репарации. О ДНК-геликазе было сообщено еще в 1989 г. [9]. Фермент был выделен из E.coli и охарактеризован как ssДНК связывающий белок с АТФазной активностью.

В настоящее время внимание сосредоточено на ферментах этого типа, выделенных из клеток человеческих тканей: ДНК-геликазе I-V, ДНК-геликазе L и др. Специфические функции ферментов данной группы детально еще не изучены. В то же время уже описан высокоизбирательный природный ингибитор нового фермента (ферментов) с оригинальной структурой - гелихиномицин (heliquinomycin) [10]. О свойствах ДНК-геликаз бактериального происхождения известно меньше, но их потенциальные возможности быть новыми мишенями в бактериальной клетке вполне вероятны.

Новые мишени для антибиотиков среди ферментов, включенных в синтез белка и пептидогликана

Процессы синтеза белка и пептидогликана хорошо изучены и большинство антибиотиков, применяемых в клинике, принадлежит к ингибиторам этих процессов. В то же время здесь использованы далеко не все возможные мишени. Так, мало обращалось внимания на ранние (дорибосомные) реакции белкового синтеза и катализирующие их ферменты. Считалось, и в целом справедливо, что обнаружить высокоизбирательные ингибиторы таких реакций труднее, чем реакций, протекающих с участием рибосом. Однако в практику все же внедрен мупироцин (псевдомоновая кислота), предотвращающий образование изолейцил-тРНК. Из-за посадки на рибосому не нагруженной изолейцином тРНК не только обрывается белковый синтез, но и включается система stringent-контроля с ее широким влиянием на метаболизм. Открывается в целом перспектива создания специфических ингибиторов образования других аминоацил-тРНК.

Недавно появилось сообщение о том, что ферменты, включенные в образование пентаглицинового мостика в пептидогликане стафилококков, потенциально могут быть мишенями для создания антимикробных агентов узкого спектра действия [11].

Новыми мишенями для ингибиторов в бактериальной (патогенной) клетке в принципе могут быть те, которые синтезируются только при инфекционном процессе и функции которых реализуются лишь in vivo. Идентификация и изучение таких мишеней на молекулярном уровне возможны с помощью таких систем скрининга, когда гены, кодирующие эти мишени, экспрессируются in vitro, т.е. именно in vitro должны демонстрироваться инфицирующие свойства и способность к выживанию в макроорганизме.

В патогенности ключевую роль играют специфические, локализованные на поверхности клеток грамположительных микроорганизмов белки, обеспечивающие адгезию, усиливающие инвазию в ткани и степень устойчивости к фагоцитозу. Многие поверхностные белки грамположительных бактерий "заякорены" С-концом в клеточной стенке, что связано с протеолитическим расщеплением секретируемых белков. Предотвращение подобного "заякоривания" может подавить у патогена способность вызывать инфекцию или сделать его более чувствительным к защитным силам хозяина.

В более широком плане речь может идти о поиске ингибиторов процессинга - не обязательно факторов вирулентности, но, например, процессинга бета-лактамаз и других защитных ферментов. При подавлении процессинга таких белковых молекул они не только не функционируют, но и могут нарушать, "застревая" в мембране, молекулярную организацию последней.

Новая техника скрининга "In vivo gene expression technology" (IVET)

К настоящему времени осознана [12] важность развития этой новой техники, с помощью которой можно контролировать именно те гены, которые селективно экспрессируются при инфекции, т.е. индуцируются у патогена только in vivo, чем отличаются от так называемых "housekeeping genes", т.е. генов, работающих in vivo и in vitro. Предложены различные варианты IVET: селекция in vivo по пуриновой ауксотрофности, по резистентности к антибиотику и др. Таким путем были обнаружены экспрессируемые in vivo и не описанные ранее гены синтеза некоторых липополисахаридов, гены, кодирующие структуру ферментов, разрушающих токсичные для патогена метаболиты хозяина и др.

Идентификация новых генов, играющих "пусковую" роль в инфекции, может начинаться и с анализа РНК-транскриптов и сопоставления транскриптов (messenger РНК), выявляемых in vitro и in vivo. С помощью обратной транскриптазы получают затем в каждом случае тотальную ДНК, которую используют в гибридизации с упорядоченной библиотекой генов исследуемого организма, конструируемой на фаге ламбда [13].

Идентификация новых генов может начинаться путем проведения негативной селекции с помощью транспозонов, содержащих уникальные последовательности нуклеотидов и используемых для мутагенеза, имеющего целью инактивацию именно тех генов, которые экспрессируются только in vivo (Signature-tagged mutagenesis) [14]. Таким путем получают авирулентные штаммы, рост которых in vitro не нарушается.

Без сомнения всем этим подходам будет способствовать решение задач, ставящих целью определение полной последовательности нуклеотидов в бактериальных геномах.

На молекулярном уровне о генах, индуцируемых in vivo, известно еще мало, как и о детерминируемых ими продуктах, их локализации в бактериальной клетке, распространении в различных видах бактерий и др.

Можно также предположить, что выключение функций продуктов, кодируемых генами, не относящимися к "housekeeping", не должно вести к быстрому распространению резистентности к соответствующим ингибиторам.

С другой стороны, в случае использования ингибиторов, направленных только на ослабление вирулентности, возрастает роль защитных сил организма, а это означает ограниченные возможности применения новых ингибиторов у больных с иммунодефицитом и, следовательно, свидетельствует о необходимости поиска новых ингибиторов при иммунодефиците.

В заключение следует подчеркнуть, что попытки внести новое в идеологию скрининга являются весьма заманчивыми, поскольку они сочетают традиционный поиск эффективных антибактериальных веществ с открытием новых потенциальных мишеней для них, жизненно важных для микроорганизма.

АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1998-N12, стр. 4-7.

ЛИТЕРАТУРА

1. Chopra I., Hodyson J., Metcalf B., Poste G. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 3: 497-503.

2. Навашин С.М. Антибиотики и химиотерапия 1997; 42: 5: 3-9.

3. Rasmussen B.A., Glazman Y., Vally F.P. Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 1658-1660.

4. Tally F.T., Ellestad G.A., Testa R.T. J Antimicrob Chemother 1995; 35: 449-452.

5. Samita Y., Nonda H., Kanatawa K., Fukasawa M. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 910-916.

6. Russell A.D., Chopra I. Understanding of antibacterial action and resistance, 2nd ed. Ellis Horwood 1996, New York, N.Y.

7. Cooper R.D., Snyder M.J., Zweifel M.J., Staszak M. et al. J Antibiot 1996; 49: 6: 576-581.

8. Сазыкин Ю.О., Навашин П.С. Антибиотики и оболочка микробной клетки. Изд ВИНИТИ, Итоги науки и техники. М 1991; 185.

9. Runnuon G.T., Lohman T.M. J Biol Chem 1989; 264: 17502-17512.

10. Chino M., Nishikawa K., Yamada A. J Antibiot 1998; 54: 5: 480-486.

11. Kopp U., Roos M., Wecke J., Labischinski H. Microb Drug Res 1996; 2: 29-41.

12. Mahan M.J., Slauch J.M., Mekalanos J.J. Science 1993; 259: 686-688.

13. Chuang S.E., Danlels D.L., Blattner F.R.J. Bact 1993; 175: 2026-2036.

14. Hensel M., Shea J.E., Gleeson C., Jones M.D., Dalton E., Holden D.W. Science 1995; 269: 400-403.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования