Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Градиентная экстракция аммонийспецифичных ионофорных антибиотиков из мицелия продуцента

А.Н. Свердлова, М.Ш. Зарецкая, М.В. Нефелова

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

В начало...


Выделенные из природных объектов стрептомицеты S.brunneofungus 118 и S.griseolus 224 синтезируют аммонийспецифичные продукты, принадлежащие к макротетролидным соединениям. С помощью градиентной экстракции мицелия продуцентов показано, что эти соединения являются достаточно лабильными как в нативных клетках, так и на синтетических носителях и подвергаются гидролизу водными растворами ацетона и этанола до различных линейных олигомеров нактиновых кислот. Ацетон стабилизирует, в основном, мономерные и димерные фрагменты, в то время как в этанольных экстрактах обнаруживается полный набор олигомеров от мономера до тетрамера. Метод градиентного экстрагирования суспензии целых клеток микроорганизмов может быть использован для изучения некоторых свойств, а также первичной идентификации биологически активных гидрофобных продуктов уже на ранних стадиях их извлечения.

Ключевые слова:

стрептомицеты, ионофоры, антибиотики.

Постоянная адаптация микроорганизмов к лечебным и профилактическим препаратам требует дальнейшего поиска новых антибиотиков и их продуцентов. Особенно это относится к антибиотикам с ионофорными свойствами, осуществляющими обмен веществ между клеткой и средой за счет взаимодействия с неорганическими катионами, в частности с ионами аммония. В настоящее время макротетролиды являются единственными антибиотиками с высокой селективностью к ионам аммония. Изменяя проницаемость клеточных мембран, эти низкомолекулярные соединения действуют не только на множество грамположительных бактерий, но также на кокцидии и некоторые клещи, что послужило основой их применения в сельском хозяйстве и животноводстве [1-3]. Низкая токсичность для теплокровных и быстрое выведение из организма не исключает возможности их использования и в медицине. Недавние исследования показали, что один из гомологов макротетролидов - тетранактин является потенциальным ингибитором экспрессии индуцируемых генов, он представляет собой новый класс ингибиторов в низкой наномолярной области и может быть использован в терапии [4, 5].

При направленном поиске и выделении продуцентов ионофорных антибиотиков из различных природных субстратов нами была составлена большая коллекция стрептомицетов, обладающих способностью синтезировать гидрофобные антибиотики с ионофорными свойствами, среди которых обнаружены аммонийспецифичные вещества. Представляло интерес выяснить, принадлежат ли они к макротетролидным антибиотикам или обладают другой химической структурой.

При работе с новыми культурами первичная идентификация продуктов биосинтеза представляет интерес уже на ранних стадиях извлечения из микроорганизма.

Целью настоящей работы является изучение аммонийспецифичных продуктов биосинтеза некоторых стрептомицетов с помощью градиентной экстракции мицелия продуцента.

Материал и методы

Объектом исследования являлись штаммы Streptomyces brunneofungus 118 и Streptomyces griseolus 224 [6].

Стрептомицеты культивировали на среде, содержащей глицерин, овсяную муку и минеральные соли, в течение 72 ч. Посевным материалом служил 48-часовой мицелий культур, выращенный на среде с крахмалом, бульоном Хоттингера и минеральными солями.

Проведение градиентной экстракции мицелия. Мицелий, промытый несколько раз водопроводной или дистиллированной водой (до исчезновения мутности в надосадочной жидкости), в виде густой суспензии в количестве 20 мл помещали в делительную воронку на 100 мл (диаметром 2,5 см) и подвергали градиентной экстракции с использованием этанола и ацетона, собирая фракции объемом 10 мл.

Извлечение ионофорных антибиотиков из мицелия S.griseolus 224 непосредственно ацетоном. К культуральной жидкости добавляли ацетон в отношении 1:1 (v/v), центрифугировали при 2000 об/мин, жидкость отбрасывали, а мицелий трижды обрабатывали ацетоном (по 25 мл на каждые 20 г мицелия) при перемешивании. Ацетоновые экстракты объединяли, добавляли равный объем этилацетата, перемешивали и удаляли ацетон из смеси промыванием водой. Затем этилацетатный слой сушили безводным сульфатом натрия, упаривали в вакууме при температуре 50њС, добавляли теплый н-гексан, помещали на холод (-8њС) и получали желтоватый осадок. Перекристаллизацию повторяли из горячего н-гексана.

Оптическую плотность и спектры поглощения определяли на спектрофотометре UV VIS (K. Zeiss, Германия).

Массовые числа определяли на масс-спектрометре СР-311А с энергией ионизирующих электронов 70 эВ и прямым вводом образца в ионный источник.

Спектры ПМР регистрировали при помощи ЯМР-спектрометра Bruker WP-250 с внутренним стандартом тетраметилсиланом.

Результаты и обсуждение

Изучаемые штаммы S.brunneofungus 118 и S.griseolus 224, синтезирующие антибиотические ионофорные продукты с селективностью к ионам аммония, были выделены из Охотского моря, первый - из морской воды, второй - из прибрежного ила [6].

Гидрофобные антибиотики с ионофорными свойствами локализуются либо на клеточной поверхности продуцента, либо в мицелии. Универсальным экстрагентом для полного выделения этих веществ являются водносмешивающиеся органические растворители, такие как этанол, изопропанол, ацетон и др. Однако эти агенты, особенно ацетон, извлекают большое количество разнообразных продуктов, и не только из клеток, но также из супернатанта, поскольку смешиваются с ним в любых отношениях, что в дальнейшем может усложнить процесс очистки. Гидрофобные продукты, локализованные на клеточной поверхности, достаточно легко могут быть извлечены воднонесмешивающимися растворителями. Примером является выделение антибиотиков актиномицинов с использованием этилацетата в качестве элюента, создающего условия для получения высокоочищенного продукта, свободного как от воднорастворимых примесей супернатанта, так и от множества клеточных компонентов. Но если гидрофобный продукт находится в мицелии, этот метод получения достаточно очищенного препарата непригоден, поскольку этилацетат, как и другие не смешивающиеся с водой органические растворители, не проникает в клетки и поэтому не может извлечь локализованные там вещества. Для экстрагирования с помощью водносмешивающихся органических растворителей только целевых продуктов, независимо от того находятся они внутри или на поверхности клетки, мы апробировали метод градиентной экстракции мицелия продуцентов. Предварительно в спектрах поглощения неочищенных этанольных экстрактов мицелия изучаемых стрептомицетов было обнаружено два максимума в ультрафиолетовой области - при 215 и 314 нм. Поэтому контроль за прохождением экстракции проводили спектрофотометрически при указанных длинах волн. Кроме этого, по аналогии с аммонийспецифичными макротетролидными антибиотиками, образующими в хлороформе желтые комплексы с пикратами аммония ($\lambda$max 377 нм), мы проводили также и эту реакцию [7].

На рис. 1 показана градиентная экстракция мицелия S.brunneofungus 118. Рис. 1А представляет градиентную экстракцию в режиме 10% водный этанол->этанол. Очевидно, что экстрагируемые вещества способны образовывать цветные комплексы с пикратом аммония (кривая с $\lambda$max 377 нм), заметно извлекающиеся из мицелия, начиная с фракции N 16, что соответствует примерно 48% концентрации этанола в воде. При этом по характеру кривой поглощение с $\lambda$max 314 нм очень сходно с поглощением при $\lambda$max 377 нм, чего нельзя сказать прo кривую с $\lambda$max 215 нм, которая показывает экстракцию из клеток продуцента помимо аммонийспецифичных большое количество более гидрофильных продуктов. Следует заметить, что область экстрагирования аммонийспецифичных продуктов достаточно большая, а кривая при $\lambda$max 377 нм представляет собой ломаную линию. Это может свидетельствовать о том, что продукт не является однородным и данный режим экстракции не позволяет их разделить. Учитывая это, мы провели экстракцию мицелия S.brunneofungus 118 в других условиях - 40% водный ацетон->ацетон (рис. 1Б) и получили несколько достаточно хорошо разрешенных пиков. При стоянии на холоду (+6 њС) из полученных фракций выпадали белые иглообразные осадки, которые отфильтровывали, высушивали на воздухе и без дальнейшей очистки подвергали масс-спектрометрическому анализу (табл. 1).

Рис. 1. Градиентная экстракция мицелия S.brunneofungus 118.
По оси абсцисс - фракция, N; по оси ординат (слева) - оптическая плотность, D, усл. ед.; по осям ординат (справа) - концентрация этанола в экстрагенте, % (А); концентрация ацетона в экстрагенте, % (Б).
А: O-O - оптическая плотность экстрагируемых продуктов при $\lambda$ 215 нм, *-* - оптическая плотность экстрагируемых продуктов при 314 нм, x-x - оптическая плотность комплексов экстрагируемых веществ с пикратом аммония, $\lambda$ 377 нм. Б: *-* - оптическая плотность экстрагируемых продуктов при $\lambda$ 314 нм.

Таблица 1. Масс-спектрометрический анализ экстрагируемых продуктов биосинтеза S.brunneofungus 118, полученных при градиентной экстракции мицелия в режиме 40% водный ацетон->ацетон
Фракция, N Kонцентрация ацетона, % Относительная интенсивность экстрагируемых веществ (усл.ед.)
Обнаруженные массовые числа (m/z), а.е.
185 199 369 383 553 567 737 751
7-9 53-56 3,0 -* - - - - - -
10-11 58-60 1,5 2,8 - 0,6 - - - -
14-15 65-67 3,0 3,0 1,5 1,0 0,1 0,1 сл сл
16-17 68-70 3,0 3,0 2,5 1,9 0,1 0,1 - -
20-24 75-81 2,5 1,1 - - - - - -
25-28 82-88 - - 1,5 - - - - -
33 95 1,3 1,1 - - - - - -
Примечание: здесь и в табл. 2, 3 знак "-" означает отсутствие данных.

Результаты показали, что кристаллические продукты имеют массовые числа, характерные для гомологичных макротетролидных антибиотиков [8]. Однако молекулярных массовых чисел этих соединений ни для нонактина (736 а.е.), ни для его высших гомологов (750, 764 а.е. и т.д.) обнаружено не было. Это означает, что экстракты содержат лишь олигомеры нактиновых кислот, биосинтетических предшественников макротетролидов, также способных образовывать комплексы с пикратом аммония [9, 10]. Экстракты содержат, в основном, мономеры и димеры нонактиновой кислоты (массовое число 185 а.е.) и гомононактиновой кислоты (массовое число 199 а.е.). Судя по интенсивности массовых пиков, основное количество этих веществ вымывается из мицелия в пределах концентрации ацетона от 58 до 70%. Циклические продукты - антибиотики макротетролиды являются более гидрофобными соединениями [1, 8].

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования