Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина | Обзорные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Интерфероны в каскаде цитокинов: исторический и современный аспекты

В.П. Кузнецов

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

В начало...


(Продолжение)

Антипролиферативный эффект

Способность ИФН тормозить размножение клеток стала известна вскоре после его открытия - уже в 1962 г. [27]. К антипролиферативному эффекту (АП) оказались чувствительными все клетки как нормальные, так и опухолевые; максимальной чувствительностью обладали быстроразмножающиеся клетки.

Высокочувствительны к АП-эффекту опухолевые клетки, характеризующиеся непрерывным неуправляемым ростом, поэтому АП-эффект давал надежду на противоопухолевую активность ИФН. Многие сотни исследователей занялись изучением этой проблемы, зачастую объединяя эти два понятия, что клинически неверно.

При применении ИФН в высоких дозах (> 1 млн МЕ) АП-эффект выражается прежде всего в цитопении. Клетки кроветворной системы высокочувствительны к ИФН. При этом подавляется как рост, так и способность к колониеобразованию в костном мозге и селезенке. Подавляется и репродукция митогенстимулированных лимфоцитов. Как правило, лимфоидный ряд более чувствителен к ИФН, чем миелоидный. Наименее подвержен действию ИФН эритропоэз.

Вместе с тем ИФН, применяемый в высоких суточных дозах (3-15 млн МЕ), вызывал циторедукцию (снижение числа циркулирующих опухолевых лейкоцитов) в среднем с 97,4x109 до 4,2x109/л с уменьшением размеров селезенки [28] у больных хроническим миелолейкозом. Эффект зависел от применяемых доз препарата (то есть достигался за счет АП-эффекта), но для достижения противоопухолевого действия и излечения были необходимы дополнительные меры, вплоть до трансплантации костного мозга.

АП-эффект носит обратимый характер. После прекращения введения ИФН кроветворение полностью восстанавливается. Возобновляется и рост опухолевых клеток. Для поддержания АП-эффекта в организме необходимо постоянное введение высоких доз ИФН.

АП-эффект определенно связан с активацией 2',5'-олиго(А)синтетазы, так как в различных культурах наблюдается параллелизм между уровнем 2',5'-олигоаденилатов в цитоплазме и степенью подавления пролиферации. Эта взаимосвязь пока непонятна. Одно не вызывает сомнений, что молекулярные механизмы развития АВ- и АП-состояний на последующих этапах, по-видимому, различны. Например, холерный токсин, изменяя физико-химическое состояние цитоплазматической мембраны и уровень цАМФ, подавляет развитие АВ-состояния, но не АП-эффект [29]. Схожим действием обладает оубаин, пуромицин и циклогексимид в определенных концентрациях.

Клетки кожно-мышечной, мезенхимальной и эпителиальной тканей в организме обычно устойчивы к АП-действию ИФН. Наиболее чувствительной моделью, используемой для измерения АП-эффекта, считаются трансформированные В-лимфоциты линии Дауди, выделенные от больных лимфомой Беркитта. При ретроспективном анализе можно заключить, что по антипролиферативному потенциалу самым активным является ИФН-$\gamma$. Он зачастую в 10-20 раз эффективнее ИФН-$\alpha$. Активность ИФН-$\alpha$ и ИФН-$\beta$ колеблется в зависимости от типа клеток, но чаще ИФН-$\beta$ имеет преимущества для клеток кожно-мышечной ткани. По антипролиферативному потенциалу правомерен следующий ряд ИФН: ИФН-$\gamma$ > ИФН-$\beta$ > ИФН-$\alpha$. При этом следует помнить,что АП-эффект свойствен всем ИФН и он всегда проявляется клинически при использовании их в высоких дозах. Так как клиническим синдромом обычно является обратимая цитопения, применять ИФН в суточных дозах > 1 млн МЕ целесообразно с активаторами кроветворения, например, с лейкинфероном.

АП-эффект проявляется только при взаимодействии ИФН со специфическими рецепторами, с последующим глубоким нарушением синтеза макромолекул. Мутанты клеток, утратившие рецептор, приобретают устойчивость как к противовирусному, так и к антипролиферативному эффектам. Следует учитывать также, что антипролиферативный эффект при невысоких дозах носит цитостатический характер: рост клеток полностью восстанавливается после удаления ИФН, хотя для этого нужно время - по крайней мере, 24 часа [30, 31].

Обзор многочисленных наблюдений [32] позволил заключить, что антипролиферативный эффект ИФН особенно выражен в подготовительный gap-период (фазы G0, G1, G2), поэтому клетки, у которых этот период короткий, а синтез ДНК (S-период) протекает интенсивно, или они находятся в фазе митоза (М-фаза), оказываются менее чувствительными.

Известно, что существует некоторый базовый уровень 2',5'-олигоаденилатов в цитоплазме, необходимый для пролиферации. Однако при введении ИФН в большинстве тканей уровень их может повышаться в 10-15 раз. Так, у мышей, получивших ИФН-$\alpha$/$\beta$, уже через 2-5 часов начинает повышаться уровень 2',5'-олигоаденилатов в селезенке, легких, печени и в меньшей степени в тимусе и головном мозге [33]. При этом, например, в клетках Дауди в цитоплазме появляются новые белки с молекулярной массой 15, 16, 20, 53, 79, 87 и 105 кДа и снижается уровень лишь одного белка - 23 кДа. В устойчивых к АП-действию мутантных клетках этой же линии лишь один белок - 15 кДа - явно не индуцируется. Уровень остальных белков оказывается существенно сниженным, но они все же обнаруживаются. Одновременно под действием ИФН подавлялась также экспрессия клеточного протоонкогена с-myc [34].

К настоящему времени известно, что в геноме человека имеется около 40 клеточных протоонкогенов, экспрессирующихся только в эмбриональных клетках, но малоактивных в зрелых. По опубликованным данным, например, у шпорцевой лягушки в процессе созревания яйцеклетки в каждой из них накапливается до 8 млн копий гена с-myc, в стадии зрелой икры их уровень также остается очень высоким - 5 млн копий, но затем после оплодотворения они распределяются при делении и каждая клетка головастика содержит уже только 20-50 копий с-myc, т.е. примерно столько же, сколько и у человека.

В геноме человека с-myc в зрелых клетках мало экспрессируется. Однако в эмбриогенезе, а также при хирургических операциях, репарационных и регенерационных процессах другого генеза происходит активация с-myc и других ростовых онкогенов c-ras и c-abl. Эти протоонкогены совершенно необходимы для начала пролиферации. Активация ростовых протоонкогенов стимулирует клетки к переходу от фазы G0/G1 к последующим стадиям клеточного цикла - S, G2 и митозу (М). Однако рост тканей генетически детерминирован и строго контролируется с участием ростовых факторов, контактного торможения, факторов апоптоза [22]. Основным регулятором экспрессии ростовых протоонкогенов является белок р53, ген которого широко представлен в геноме млекопитающих.

В клетках кроветворной системы экспрессия гена р53 приводит к физиологическому явлению - программированной смерти - апоптозу. Препятствует этому белок гена bcl-2. Таким образом, увеличение экспрессии ростовых протоонкогенов создает условия для неконтролируемого роста и малигнизации (особенно при точечных мутациях, трансформирующих протоонкоген в онкоген, или при включении его в вирусный геном и влиянии вирусного энхансера). Снижение их экспрессии под действием ИФН или р53 (участвует и белок Rb, который здесь не рассматривается) подавляет рост и пролиферацию. Но, конечно, этим процессы не ограничиваются, на самом деле они гораздо сложнее.

При опухолевой трансформации должна происходить активация с-myc и других ростовых онкогенов. Интересно, что для поддержания трансформированного фенотипа необходима постоянная экспрессия онкогенов и обусловленное этим присутствие онкобелков в цитоплазме. Введение в нормальную клетку онкобелков приводит к появлению фенотипических признаков трансформации, которые начинают исчезать по мере деградации онкобелков. Введение в цитоплазму трансформированных клеток антител против онкобелков также приводит к временному восстановлению фенотипически нормальных клеток. Таким образом, трансформированная клетка, потерявшая специфические функции (дифференцировка) и характеризующаяся неконтролируемым ростом, при подавлении экспрессии ростовых онкогенов под действием ИФН может быть возвращена к фенотипической норме. Это крайне важно знать каждому врачу.

Существует несколько путей активации клеточных протоонкогенов - точечные мутации, геномная амплификация, накопление транскриптов или, наконец, транслокация генов, описанная для хронического миелолейкоза (ген c-abl 9:22) или лимфомы Беркитта (ген с-myc 8:14) [35]. Транслоцированный ген попадает под влияние нового промотора и может активироваться. Важную роль могут играть и онкогенные вирусы, несущие эти онкогены (как правило с незначительными изменениями) и способные встраивать их в геном. Однако, не вызывает сомнения, что для человеческих опухолей наиболее вероятны точечные мутации в гене р53, которые обнаружены по крайней мере в 50% клеток опухолей, характерных для США и Англии [36]. Предполагается, что факт мутации гена р53, снижающий контроль за активностью ростовых онкогенов, только создает условия для опухолевого роста. Их клинического проявления следует ожидать в промежутке до 30 лет, когда включаются и другие сигналы или слабеют механизмы противоопухолевого иммунитета.

Возможности ИФН предотвращать противоопухолевые процессы несомненны, хотя бы через влияние на экспрессию ростовых онкогенов. Но они совершенно не изучены.

На примере гена с-myc в клетках Дауди впервые в 1984 г. было показано, что ИФН I типа может рассматриваться как отрицательный регулятор экспрессии ростовых онкогенов, что, по крайней мере, частично может объяснять АП-эффект в нормальных тканях [37]. Позднее этот эффект наблюдался и с другим ростовым онкогеном c-Ha-ras. Эффект чаще реализуется на уровне трансляции онкогена (уровень белка). На примере с-myc показано, что ДНК-связывающий белок р62 кДа, который является продуктом с-myc, необходим для лигации ДНК-фрагментов Окадзаки в единую спираль. Его подавление при введении ИФН препятствует синтезу новой ДНК, с последующим торможением пролиферации.

Однако известны и другие примеры подавления репликации без выраженного влияния на экспрессию ростовых протоонкогенов (клетки моноцитарного ряда И-937, HL-60, эритролейкемии Френда, Balb c/3T3). Система 2',5'-олиго-(А)синтетаза-РНКаза L может играть в этом процессе важную роль, обеспечивая быструю деградацию вновь синтезируемых mРНК, необходимых для пролиферации [38].

Иммуномодулирующее действие

Долгое время ИФНы рассматривались как факторы, влияющие на функции соматических клеток без участия иммунной системы. Действительно, АВ- и АП-эффекты можно наблюдать в культуре тканей.

В течение почти целого десятилетия препараты ИФН применялись как противовирусные средства, способные защитить клетку от вирусной инфекции без участия иммунных эффекторов. Хотя уже тогда целый ряд клинических наблюдений, например, стимуляция репаративных процессов в ранах, в том числе сильно инфицированных [39, 40], и обширных ожогах [41] не укладывался в общую схему и нуждался в новом осмыслении [2].

Большой интерес привлекло исследование, проведенное в Центре приматов в Голландии, показавшее, что у обезьян, зараженных высокочувствительным к ИФН штаммом вируса осповакцины или его мутантом, устойчивым к дозе ИФН, практически не достижимой в организме (> 10 тыс. МЕ), при последующем их лечении ИФН не наблюдалось значительных различий в клинической динамике и напряженности развившегося иммунитета. В обоих случаях ИФН предотвращал вирусное поражение. Это указывало на преимущественную роль иммунных эффекторов, активированных ИФН, в процессах элиминации вируса и последующем клиническом выздоровлении.

С позиций сегодняшнего дня можно утверждать, что активация неспецифических клеточных реакций иммунитета и регуляция эффекторов в иммунном ответе, по-видимому, - основная функция ИФН в организме[4]. При взаимодействии с патогеном ИФНы вырабатываются макрофагами и лимфоцитами, возникает воспалительная реакция, которая приводит к деструкции патогена в очаге при минимальном поражении нормальных тканей. Известно, что в норме здоровье поддерживается, главным образом, с помощью неспецифических клеточных реакций иммунитета, осуществляемых известной триадой иммунных эффекторов: макрофагом, Т-хелперным лимфоцитом и нейтрофильным фагоцитом. Макрофаг в данном случае рассматривается как универсальная антиген-представляющая клетка (АПК), предъявляющая процессированный антиген Т-лимфоциту, вместе с активирующими цитокинами. Роль АПК выполняют также дендритные клетки и клетки Лангерганса (кожа). Но суть явления при этом не меняется. АПК предъявляет процессированный антиген в комплексе с главным комплексом гистосовместимости (ГКГ) 2 класса (вирусные и опухолевые антигены в комплексе с ГКГ 1 класса), который должен распознаваться Т-клеточным рецептором (TCR) СДЗ+-лимфоцитов. Известно, что иммуногенность процессированного антигена возрастает примерно в 10000 раз, а 100 комплексов антиген + ГКГ 2 класса способны взаимодействовать с 18000 TCR [42]. Это характеризует эффективность иммунного распознавания.

Роль антигена может выполнять любой патоген, который сначала убивается с помощью перекисных киллинговых реакций, затем интернализуется. Последующие реакции неспецифического ответа показаны на рис. 1. Под действием антигена макрофаг должен активироваться, продуцируя аутокринно ИНФ-a и ИЛ-6. Антигены ГКГ 2 класса постоянно на макрофаге не экспрессируются и их появление стимулируется ИФН-$\gamma$ и ИЛ-4. Процесс подавляется трансформирующим фактором роста ТФР-$\beta$, которыйтакже может продуцироваться макрофагами. Источником ИФН-$\gamma$ всегда служат активированные Т-лимфоциты.

Рис. 1. Аутокринно-паракринная регуляция 1-й фазы иммунного ответа.

Прямой контакт макрофага и Т-хелперного лимфоцита, осуществляющийся через структуры антиген + ГКГ 2 класса и TCR, дополняется также трансмембранными гликопротеинами ICAM. Это обеспечивает рестрикцию иммунного ответа, но оказывается недостаточным для активации Т-лимфоцитов. Необходим второй сигнал в виде комплекса цитокинов, продуцируемых активированными макрофагами: это прежде всего ИФН-a, а также ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-$\alpha$, которые взаимодействуют с соответствующим рецептором на Т-хелперной клетке.

Активированный Т-хелперный лимфоцит, поддерживая макрофаги, выделяет в среду такие цитокины, как ИФН-$\gamma$ (стимулирующий экспрессию ГКГ 2 класса), а также ИЛ-4 (активирует гены ГКГ 1 класса), МИФ и ЛИФ, удерживающие макрофаги в очаге воспаления и колониестимулирующие факторы (КСФ) - М-КСФ и ГМ-КСФ. Вследствие взаимного сбалансированного влияния активированных макрофагов и Т-хелперных лимфоцитов поддерживается состояние их активации и достигается амплификация иммунного ответа за счет ускорения дифференцировки макрофагов из ранних предшественников моноцитов/макрофагов.

Сигналы активации от макрофагов (ИФН-$\alpha$, ИЛ-1, ФНО-$\alpha$, ИЛ-8, Г-КСФ и ГМ-КСФ) и Т-хелперных лимфоцитов (ИФН-$\gamma$, ИЛ-3) воспринимаются нейтрофильными фагоцитами, способствуя их дифференцировке и стимулируя фагоцитарную функцию. При этом повышаются все параметры фагоцитоза - число зрелых сегментоядерных нейтрофилов, генерация перекисей, фагоцитарные индекс и число, а также (что самое главное) завершенность фагоцитоза. Можно сказать, что на этом круг замыкается.

Основным отрицательным сигналом для всей системы является ИЛ-10, который может продуцироваться как макрофагами, так и Т-лимфоцитами. Но главная регуляторная роль в этом процессе принадлежит, по-видимому, Т-лимфоцитам. Специфические антитела в этих реакциях могут не участвовать.

Вся совокупность клеточных реакций элиминации антигена, вовлекающих макрофаги (или другие АПК), Т-лимфоциты и нейтрофильные фагоциты, при которых нет необходимости в пролиферации и дифференцировке Т-лимфоцитов, может считаться первой фазой иммунного ответа. Она тесно связана со следующей - второй фазой, которая начинается на уровне пролиферирующих Т-лимфоцитов и определяет основное направление в последующих реакциях организма на патоген, когда начинают включаться клеточные (в частности ГЗТ) или гуморальные пути иммуногенеза.

Первая фаза иммунного ответа постоянно функционирует и является, по-видимому, основной немедленной реакцией организма при невысоких нагрузках патогена. Она включается сразу же после распознавания антигена. Ее участниками являются иммунные эффекторы, дифференцированные к данному моменту, но, с другой стороны, именно она создает базис для последующих иммунных реакций. Защитная роль реакций первой фазы иммунного ответа исключительно высока и, по-видимому, недооценивается врачом.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования