Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Биохимия | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Научные статьиЗначение фармакокинетических исследований при использовании антибиотиков у детей, больных пневмонией: (1)

Научные статьиДействие собственного антибиотика на продуцент имбрицина при выращивании на агаризованной среде: Материал и методы

Новый математический подход при определении концентрации антибиотиков методом диффузии в агар

С.Е. Есипов, Л.Л. Жиркова, В.В. Воронкова.

Государственный научный центр по антибиотикам, Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва.

В начало...


Предложен математический подход - уравнение прямых, проходящих через одну точку, для расчета биологической активности антибиотиков с использованием метода диффузии в агар, который после незначительных изменений постановки эксперимента позволяет резко сократить объем работ и материала для статистической обработки. В отличие от известных методов на каждую чашку в три лунки наносят анализируемое вещество, в трех различных концентрациях, а в остальные три лунки - стандарт в одной контрольной концентрации. Биологическую активность антибиотика рассчитывают по уравнению lg cn = lg cst + (dn - dst)/bi, если между логарифмом дозы и размерами диаметров зон подавления роста тест-микроба существует прямая зависимость, или по уравнению lg cn = lg cst + ( dst - dn)/bi , если между логарифмом дозы и размеров диаметров зон существует обратная зависимость, например, если доза выражена разведениями. Коэффициент bi определяется экспериментально для каждого анализируемого образца по средним значениям размером диаметров зон подавления роста с помощью программ простой линейной регрессии.

Ключевые слова:

биологическая активность антибиотиков, метод диффузии в агар, математический анализ.

В основе количественного определения концентрации антибиотиков методом диффузии в агар лежит установленная американским исследователем Блиссом [1, 2] линейная зависимость между логарифмом концентрации и величиной диаметра зоны подавления роста микроорганизма, выраженная уравнением:

d = a + b * lgC (1)

Графически эта зависимость представляет собой прямую линию в координатах: Х = lg C и Y = d, которую использовали в качестве стандартной кривой, построенной по не менее 5 концентрациям растворов стандартного препарата антибиотика. Однако на практике, от опыта к опыту наклон и положение стандартных кривых, а следовательно и величины коэффициентов а и b, сильно менялись. Чтобы как-то выйти из этого положения Ваксман предложил вносить поправку к экспериментальным данным по зоне опорной концентрации стандартного образца, которая постоянно наносилась на чашки с анализируемыми образцами [3]. В конечном итоге это привело к тому, что полученные экспериментальные данные приводили в соответствие с шаблонами, которыми являются калибровочные кривые, построенные таким образом, чтобы контрольные концентрации стандарта для всех антибиотиков давали зону подавления роста 17 мм.

Необходимые для этого экспериментальные данные получали путем нанесения на каждую чашку с 6 лунками контрольной концентрации стандарта (ККС) (3 лунки), а в остальные три лунки вносили либо раствор стандарта, для построения калибровочной кривой, либо раствор анализируемого препарата. После этого полученные экспериментальные диаметры зон задержки роста ККС и разведений анализируемых проб приводились в соответствие с диаметром зоны ККС, по которой построена калибровочная кривая. Так, если экспериментальные величины диаметров зон задержки роста ККС были меньше 17 мм, то все экспериментально полученные диаметры зон задержки роста по всем чашкам нужно увеличить на недостающие величины, и, наоборот, если диаметры зон задержки роста ККС были больше 17 мм, то все экспериментальные диаметры зон подавления роста уменьшали на эту разницу. Эта трудоемкая работа, связанная с пересчетом сотен экспериментально полученных величин, была действительно необходима, когда у экспериментатора, кроме графически построенной кривой, не было других возможностей для определения концентрации антибиотиков на основе этого метода.

Поскольку пересчет огромного массива цифр представлял значительные трудности, с появлением персональных ЭВМ эту работу передали машинам, математикам, программистам. При этом задачи, которые ставили микробиологи перед математиками, мало чем отличались от задач, связанных с определением концентрации антибиотиков с помощью калибровочной кривой.

Естественно математики не строили уже калибровочных графиков, а рассчитывали коэффициенты а и b уравнения (1) по программе линейной регрессии, и подставляя скорректированные микробиологами диаметры зон задержки роста ККС и анализируемых растворов в уравнение (2), рассчитывали искомые концентрации:

lg Ci= (di - ast)/bst; anti lg Ci=Ci (2)

Если полученные математиками результаты укладывались в принятую для этого метода ошибку определения 5%, все было хорошо, однако, если по каким-либо причинам нужные результаты не получались, то ни математики, ни микробиологи не могли определить причины этого, поскольку они часто не понимали друг друга, так как микробиологи высококвалифицированно выполняли свой шаблонный участок работы ("капальщики"), а математики свой ("счетоводы"). При этом, как показал опыт работы с каждой из этих групп специалистов во ВНИИА (теперь ГНЦА), они очень ценили и держали в секрете свои профессиональные навыки.

Первая попытка отказаться от использования калибровочной кривой была сделана в 1958 г. В.С. Дмитриевой [4]. Для своего времени, когда еще не было ни программируемых микрокалькуляторов (ПМК), ни, тем более, персональных ЭВМ, она нашла прогрессивное решение для замены калибровочной кривой таблицами. Биологическая активность антибиотиков по этим таблицам определяется уже несколькими поколениями микробиологов, биохимиков, медиков. При составлении этих таблиц автору необходимо было принять ряд ограничений, а именно, что диаметр зоны подавления ККС для всех антибиотиков равен 17 мм, а разница двух разведений равна 2. При этом автору не удалось четко сформулировать принцип, по которому были составлены таблицы, хотя бы в ограниченном варианте, а последующие поколения пользовались этими таблицами чисто механически.

Это, по-видимому, послужило причиной того, что пришедшее на смену поколение микробиологов, которое занималось разработкой биологического контроля антибиотиков во ВНИИА, где были разработаны эти таблицы, не поддержало этого направления, а осталось приверженцем варианта, использующего калибровочную кривую (однодозный метод), а в ответственных случаях, для титрования стандартов антибиотиков, использовало трехдозный метод [5].

При использовании однодозного метода определения антибиотической активности удается получить средний результат с интервалом ошибки не выше 5% лишь путем многократного подбора разведений анализируемых образцов, который позволяет в конце концов подобрать такую концентрацию анализируемого образца, которая позволяет получить диаметр зоны подавления роста, равный (или близкий к нему) диаметру зоны подавления роста ККС. При таком подходе уменьшается ошибка, связанная с различиями величины коэффициентов b для стандартной кривой и анализируемых образцов. Для достижения этого авторы рекомендуют проводить не менее 6 повторных испытаний в разные дни (не менее 2 дней), так как средняя величина активности отдельных определений, проведенных в разные дни, более надежна, чем средняя, полученная в результате такого же количества определений, проведенных одновременно [6].

Естественно при таком требовании к методу его едва ли можно применять для массового анализа при определении концентрации антибиотиков в культуральных жидкостях и экстрактах при проведении селекционных работ, оптимизации условий биосинтеза и отработке оптимальных методов очистки антибиотиков.

Поскольку эта задача постоянно вставала перед нами в наших исследованиях, мы нашли оптимальный вариант, который позволил нам эффективно использовать метод диффузии в агар при решении перечисленных выше задач. Для лучшего понимания и наглядности преимуществ предлагаемого метода рассмотрим его применение на конкретных примерах определения биологической активности антибиотиков тилозиновой группы.

Микробиологическая часть работы выполнена по методикам, используемым в лабораториях ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов. Трехдозный метод анализа препаратов с контрольной концентрацией стандарта и математический аппарат для обработки экспериментальных данных разработан нами.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования