Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Зарегистрируйтесь на нашем сервере и Вы сможете писать комментарии к сообщениям Обратите внимание!
 
  Наука >> Медицина >> Химиотерапия и антибиотики | Научные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Анализ перестроек генома у мутантов Streptomyces kanamyceticus

В.А. Федоренко, Л.М. Голец, Ю.А. Демидчук, Г. Крюгель

Львовский университет им. И. Франко, Украина.

В начало...


Анализ, проведенный методом пульс-электрофореза, показал, что эндонуклеазы рестрикции AseI и DraI расщепляют хромосомную ДНК исходного штамма S.kanamyceticus 1 соответственно на 16 и 12 фрагментов. Общий размер хромосомной ДНК этого штамма составляет 7715 (сумма размеров DraI-фрагментов) - 7788 т.п.н. (сумма размеров AseI-фрагментов). В хромосомных ДНК нестабильного Kan--мутанта kan12, а также мутанта genR10, характеризующегося повышенной устойчивостью к канамицину и гентамицину, обнаружены перестройки. По сравнению с ДНК исходного штамма S.kanamyceticus 1 и стабильного мутанта kanC782, у kan12 отсутствуют два AseI-фрагмента 98 и 220 т.п.н., но обнаруживаются два дополнительных фрагмента 297 и 450 т.п.н. В ДНК мутанта genR10 утрачен AseI-фрагмент 420 т.п.н., но имеется дополнительный фрагмент 450 т.п.н. У kan12 и genR10, а также еще у двух мутантов (genR8 и genR8.1), резистентных к указанным антибиотикам, обнаружены амплификации гена kmr, детерминирующего устойчивость S.kanamyceticus 1 к канамицину. Амплификация наиболее интенсивна у наиболее устойчивого мутанта genR8.1.

Ключевые слова:

Streptomyces kanamyceticus, хромосомная ДНК, перестройка генома, пульс-электрофорез.

Streptomyces kanamyceticus является продуцентом канамицина - аминогликозидного антибиотика медицинского назначения. Для штаммов Streptomyces kanamyceticus характерна нестабильность антибиотической активности [1, 2]. Ранее мы показали [1], что и большинство мутантов S.kanamyceticus с нарушенным биосинтезом канамицина являются нестабильными. Установлено, что генетическая нестабильность признаков актиномицетов, обусловлена, главным образом, перестройками их генома [3, 4]. В последнее время для определения размера генома актиномицетов и изучения его организации широко применяют метод пульс-электрофореза макрофрагментов ДНК [5-10]. Очевидна и перспективность его использования для анализа механизмов нестабильности генома актиномицетов [6, 8, 11].

Настоящая работа посвящена идентификации при помощи метода пульс-электрофореза перестроек генома у представителей двух групп мутантов S.kanamyceticus: с нарушенным биосинтезом канамицина (Kan-) и повышенной устойчивостью к аминогликозидным антибиотикам.

Материал и методы

В работе использованы штаммы Streptomyces kanamyceticus VNIIA 1375, 1, Streptomyces fradiae VNIIA 1040, Micromonospora purpurea VNIIA 1634, Micromonospora zionensis VNI-IA 1611, полученные из музея культур ГНЦА (Москва) и мутанты S.kanamyceticus 1 - kanC782, kan12, genR10, genR8, genR8.1, выделенные ранее [1, 12]. Указанные штаммы выращивали как описано [1]. Рекомбинантная плазмида pUS8, содержащая в составе 0,85 т.п.н. SacI - SphI-фрагмента ген устойчивости S.kanamyceticus 1 к канамицину kmr, была использована как источник ДНК-зонда в экспериментах по ДНК-гибридизации. pUS8 получена на основе pIJ702 [13]: в BglII-сайте клонирован 1,8 т.п.н. Sau3A-фрагмент ДНК S.kanamyceticus 1, а в PstI-сайте - колийный вектор pUC18. Эта плазмида поддерживается в E.coli и Streptomyces lividans 66 и детерминирует устойчивость S.lividans 66 к 1000 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл гентамицина.

Суммарную и плазмидную ДНК актиномицетных штаммов выделяли по методикам, описанным в руководстве Hopwood и соавторов [13]. Суммарную ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикции BamHI, PvuII, KpnI, PstI (MBI Fermentas) в условиях, рекомендуемых изготовителем. Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле в ТАЕ-буфере [13]. Перенос фрагментов ДНК на нейлоновые фильтры Hybond (Amerscham) осуществляли в течение 30 ч, используя 0,4 М NaOH. Фильтры прогревали при 120њС 20 мин. Введение дигогсигениновой метки (DIG) во фрагмент ДНК, ДНК - гибридизацию и иммунологическую детекцию гибридизовавшихся проб проводили при помощи набора для DIG-мечения и детекции (Boehringer Manheim) по методике, рекомендованной изготовителем.

Для приготовления образцов ДНК для пульс-электрофореза штаммы S.kanamyceticus 1, kanC782, kan12 и genR10 выращивали в среде TSB (Serva) при 28њС на качалке (180 об/ мин) в течение 24 ч. Затем культуру переносили в свежую среду TSB с 0,2% глицина и выращивали в тех же условиях еще 20 ч. Протопласты штаммов S.kanamyceticus получали по методике, описанной Hopwood и соавторами [13]. Суспензии протопластов в среде Р хранили при -80њС. Для приготовления агарозных блоков использовали смесь 200 мкл суспензии протопластов (титр 2x109 протопластов/мл), 900 мкл расплавленной и охлажденной до 44њС 1% InCert-агарозы (FMC) и 150 мкл HES-буфера (25 мМ HEPES-NaOH, pH 8,0, 25 мМ ЭДТА, 0,3 М сахароза). Полученные агарозные блоки инкубировали в течение 48 ч при 50њС в растворе протеиназы К (2 мг/мл) в NDS-буфере (1% N-лауроилсаркозин натрия, 0,5 М ЭДТА, 10 мМ глицин, рН 9,5). Через 24 ч его меняли на свежий с такой же концентрацией протеиназы К. Протеиназу К инактивировали, добавляя 40 мкг/мл фенилметилсульфонилфлюорида (Sigma) в НЕ-буфере (10 мМ HEPES-NaOH, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА). Режим обработки - 1 ч при 4њС. После этого агарозные блоки промывали 10 раз по 20 мин в 5 мл НЕ-буфера при медленном перемешивании при 4њС. Их хранили в NDS-буфере при 4њС. Для расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции использовали агарозные блоки размером 1x2x8 мм. Объем инкубационной смеси - 150 мкл. В работе применяли рестриктазы AseI (VspI), BfrI (BspTI) (MBI Fermentas), PacI (NE BioLab) и DraI (Gibco BRL). В инкубационную смесь вносили по 5 ед. указанных ферментов. Режим инкубации - от 1 до 4 ч при 37њС. Электрофоретическое разделение полученных макрофрагментов ДНК проводили в 1% стерильной Sea Kem Gold - агарозе (FMC) в 0,5X HEPES-буфере (16 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 16 мМ ацетат натрия, 0,8 М ЭДТА) в аппарате CHEF DRII (Bio Rad) при температуре буфера 12њС. В качестве маркеров использовали хромосомы Saccharomyces cerevisiae и конкатамеры ДНК фага лямбда (NE BioLab). Денситометрический анализ электрофореграмм проводили как описано ранее [6].

Результаты и обсуждение

Проведен анализ при помощи пульс-электрофореза суммарной ДНК исходного штамма S.kanamyceticus 1 и его трех мутантов: kanC782 (стабильный Kan--мутант, не образующий 2-дезоксистрептамин), kan12 (нестабильный Kan--мутант, который не синтезирует канамицин А) и genR10 (с повышенной устойчивостью к канамицину и гентамицину) [1, 12]. В отличие от ранее опубликованных методик приготовления препаратов актиномицетной ДНК для пульс-электрофореза [5, 6, 9], мы иммобилизовали в агарозном геле не мицелий, а протопласты указанных штаммов. При выращивании актиномицетов в жидкой среде часто образуются комки мицелия разного размера. Это препятствует равномерному распределению мицелия в агарозном блоке. Использование суспензий протопластов устраняет это осложнение. Кроме того, отпадает этап лизиса клеточных стенок лизоцимом, что значительно ускоряет и удешевляет методику. Поскольку ДНК актиномицетов имеет высокий ГЦ-состав (70-74%) [14], для получения макрофрагментов хромосомной ДНК S.kanamyceticus мы использовали эндонуклеазы рестрикции, сайты узнавания которых содержат лишь АТ-пары, либо преимущественно АТ-пары: AseI (AT-TAAT), DraI (TTTAAA), PacI (TTAATTAA), BfrI (ЦТТААГ).

В контрольных экспериментах мы проводили пульс-электрофорез образцов ДНК штаммов 1, kanC782, kan12, которые не обрабатывались названными выше эндонуклеазами в условиях разделения молекул ДНК размером от 40 до 1000 т.п.н. (время пульса 10-120 сек, 140 В, 24 ч). Это позволяет выделить такие внехромосомные ДНК, которые нельзя фракционировать при обычном электрофорезе. Попытки выделить плазмиды из мицелия указанных штаммов при помощи метода щелочного лизиса [13] дали негативные результаты. Ни в одном из этих штаммов не удалось идентифицировать плазмиды и при помощи пульс-электрофореза. Это позволяет сделать вывод об отсутствии автономных плазмид в клетках исследованных нами штаммов S.kanamyceticus.

При расщеплении ДНК исследуемых штаммов S.kanamyceticus эндонуклеазой PacI мы получили по два фрагмента размером 530 и 590 т.п.н. и фракцию фрагментов, больших чем 1900 т.п.н., которые нам не удалось четко разделить и идентифицировать. Очевидно, в ДНК S.kanamyceticus есть лишь несколько сайтов расщепления рестриктазой PacI, которая узнает последовательность из восьми АТ-пар. Исходя из этого, мы сделали вывод о нецелесообразности использования PacI для анализа перестроек в хромосомах мутантов S.kanamyceticus. В то же время обработка препаратов ДНК штаммов 1, kanB782 и kan12, genR10 эндонуклеазой BfrI, сайт узнавания которой содержит две ГЦ-пары, дает большое число (> 30) фрагментов, абсолютное большинство которых по размеру меньше 340 т.п.н. (рис. 1). Судя по относительной интенсивности полос ДНК, часть фрагментов являются двойными. Поэтому в дальнейшем мы сосредоточились на анализе AseI- и DraI-фрагментов ДНК исследуемых штаммов.

Рис. 1. Электрофореграммы AseI и BfrI-рестриктов ДНК S.kanamyceticus 1, kanC782, kan12 и genR10.
А . Время пульса 20-90 сек, 170 В, 22 ч.
1-3 - BfrI-фрагменты (1 - kan12, 2 - kanC782, 3 - штамм 1); 4-6 - AseI-фрагменты (4 - kan12, 5 - kanC782, 6 - штамм 1); 7 - хромосомы S.cerevisiae.
Б . Время пульса 5-50 сек, 190 В, 18 ч.
1 - AseI-фрагменты genR10; 2-4 - BfrI-фрагменты (2 - kan12, 3 - kanC782, 4 - штамм 1); 5-7 - AseI-фрагменты (5 - kan12, 6 - kanC782, 7 - штамм 1).
В . Схематическая интерпретация А и Б.

Для фракционирования фрагментов ДНК штаммов S.kanamyceticus 1, kanC782, kan12 и genR10, полученных после обработки эндонуклеазой AseI, использовали такие режимы: 1) изменение времени пульса от 5 до 50 сек, 190 В, 18 ч; 2) 30-120 сек, 140 В, 24 ч; 3) 20-90 сек, 170 В, 22 ч; 4) 5-120 сек, 180 В, 20 ч. При первом режиме достигалось хорошее разделение фрагментов размером от 40 до 300 т.п.н., при втором - от 200 до 800 т.п.н., а при третьем и четвертом - фрагментов больших размеров. При этом идентифицированы 16 AseI-фрагментов ДНК исходного штамма 1, размеры которых варьируют от 40 до 1500 т.п.н. (таблица, см. рис. 1). Денситометрический анализ относительной интенсивности полос, которые соответствуют фрагментам 123, 220, 480, 750 и 820 т.п.н., показал, что они являются двойными. Аналогичная картина распределения AseI-фрагментов получена при расщеплении ДНК мутанта kanC782. Однако при анализе ДНК мутантов kan12 и genR10 обнаружены отличия в распределении AseI-фрагментов. По сравнению с ДНК штаммов 1 и kanB782, в ДНК мутанта kan12 отсутствуют фрагмент размером 98 т.п.н. (обозначен в таблице как D), один из двух фрагментов размером 220 т.п.н. (J), а также обнаруживаются дополнительные фрагменты 297 (J') и 450 (К') т.п.н. (см. рис. 1, таблица). В ДНК мутанта genR10 в отличие от других исследованных штаммов отсутствует фрагмент К (420 т.п.н.), однако, как и в ДНК штамма kan12, имеется фрагмент К' (450 т.п.н.) (рис. 1, Б). Фракционирование DraI-фрагментов ДНК штаммов 1, kanC782 и kan12 проводили при изменении времении пульса от 5 до 120 сек (170 В, 15 ч, 12њС). После обработки ДНК штамма 1 получено 12 фрагментов, имеющих размеры от 40 до 1800 т.п.н., в том числе двойной фрагмент размером 295 т.п.н. (таблица, рис. 2). Аналогичные DraI-фрагменты обнаружены в ДНК штамма kanC782. В то же время при расщеплении рестриктазой DraI ДНК штамма kan12 обнаружен дополнительный фрагмент В' размером 150 т.п.н.

Таблица. Размеры AseI- и DraI-фрагментов хромосомной ДНК штаммов S.kanamyceticus 1, kanC782 и kan12 (т.п.н.)
AseI-фрагменты DraI-фрагменты
1 и kanC782 kan12 1 и kanC782 kan12
A 40 A 40 A 40 A 40
B 45 B 45 B 85 B 85
C 66 C 66 C 295 B' 150
D 98 E 123 D 295 C 295
E 123 F 123 E 330 D 295
F 123 G 138 F 510 E 330
G 138 H 220 G 550 F 510
H 220 J 240 H 620 G 550
I 220 J' 297 I 760 H 620
J 240 K 420 J 880 I 760
K 420 K' 450 K 1550 J 880
L 455 L 455 L 1800 K 1550
M 480 M 480     L 1800
N 480 N 480  
O 750 O 750  
P 750 P 750  
Q 820 Q 820  
R 820 R 820  
S 1500 S 1500  
Сумма 7788   8217   7715   7865

Рис. 2. Электрофореграмма DraI-рестриктов ДНК S.kanamyceticus 1 и kan12.
А. Время пульса 5-120 сек, 170 В, 15 ч.
1 - kan12; 2 - штамм 1.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования