Научная Сеть >> Исследование уровня молекул средней массы и процессов перекисного окисления липидов в крови больных с разными формами инсульта

Приводятся результаты исследований крови 81 больного с ишемическим и геморрагическим инсультом с целью проследить взаимосвязь процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и накопления в крови молекул средней массы (МСМ) при различных вариантах инсульта. Проводили гельпроникающую хроматографию УФ-монитором при длине волны 254 нм на колонке, заполненной гелем. Разделенные фракции регистрировали. Учитывали характер спонтанной и Fe2+-индуцированной хемилюминесценции, уровень малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгат - ДК. Установлено, что при инсультах уровень процессов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах достоверно повышается, особенно при геморрагической форме. В крови почти вдвое возрастают общее содержание МСМ, особенно фракций А и А4 и фракций D и F. То есть, наблюдается параллелизм между накоплением МСМ в крови больных инсультом и индукцией ПОЛ, которые могут быть фактором генерации МСМ. Делается вывод, что накопление определенных классов МСМ в крови при инсультах связано с процессами ПОЛ, которые в своей совокупности обусловливают глубину вторичных патохимических изменений в тканях головного мозга, что следует учитывать при разработке методов медикаментозного лечения и оценки прогноза заболевания.

При различных патологических состояниях (токсемия, инфаркт миокарда, циркуляторный шок, уремия, онкологические заболевания) [12, 16] в плазме крови появляются в повышенных концентрациях так называемые молекулы средней массы (МСМ), охватывающие диапазон с молекулярной массой (мол. м.) 300-5000 Да. Подобного рода молекулы представляют собой продукты распада белков и их комплексов [5, 12] и чаще всего играют роль эндотоксинов [3, 9, 17]. МСМ, нарушая физико-химические свойства клеточных мембран, делают их более доступными для разного рода повреждающих воздействий, включая процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [8, 15]. Роль МСМ в патогенезе острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК) изучена недостаточно [2, 10].

В настоящей работе ставилась цель проследить связь процессов ПОЛ с накоплением в крови МСМ при различных вариантах ОНМК.

Проведен анализ плазмы и эритроцитов крови у 81 больного (37 женщин и 44 мужчины) в возрасте от 41 года до 82 лет, перенесших геморрагический (40 человек) или ишемический (41 человек) инсульт. При постановке диагноза использованы критерии диагностики сосудистых заболеваний головного мозга Е.В. Шмидта и соавт. [18]. Основными заболеваниями, приведшими к инсульту, были гипертоническая болезнь, атеросклероз сосудов головного мозга и их сочетание. Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров такого же возраста, что и пациенты основной группы.

Гельпроникающую хроматографию проводили на колонке (40 1,6 см), заполненной поливиниловым гелем TSK-Gel Toyoperl HW-40 Fine ("Tokyo Soda Manufacturing Co", Япония), дающей линейное распределение полипептидных молекул в диапазоне мол. м. от 10 000 до 100 Да. В колонку вводили 0,1-0,15 мл цельной плазмы; в качестве элюента использовали фосфатно-солевой буфер ( - 0,02 Na 2HPO4 моль/л, рН 7,0 с содержанием 0,1 моль/л NaCl и 0,1 моль/л мочевины). Разделенные фракции регистрировали на выходе из колонки УФ-монитором ("2238-Uvicord S II", LKB) при длине волны 254 нм. Оптический сигнал записывали в виде хроматограмм на двухканальном самопишущем потенциометре ("2210 Recorder", LKB), что давало возможность получения их записи в двух масштабах: 2 AUFS и 0,02 или 0,05 AUFS, т.е. при 100- и 40-кратном увеличении чувствительности регистрирующего прибора. Колонку калибровали стандартными пептидами с известной мол. м. (инсулин - 6000 Да; инсулинb-цепь - 3496 Да; инсулинa-цепь - 2532Да; соматостатин - 1638 Да). После хроматографирования стандартов строили график зависимости объема элюирования ( V R) и логарифма мол. м., по которому определяли среднюю мол. м. фракций пептидов плазмы крови.

Для выявления интенсивности ПОЛ в плазме учитывали характер спонтанной и Fe2+-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) 5% суспензии клеток в растворе Dulbeco. Интенсивность ХЛ оценивали по светосумме медленной вспышки, которую вычисляли как площадь под кривой от начала медленной вспышки до достижения ХЛ максимального значения. Измерения проводили на биохемилюминометре БХЛ-06. Процесс индуцировали 0,25 мМ раствором и измеряли на протяжении 3 мин. Уровень малонового FeCl2 диальдегида (МДА) в плазме крови и эритроцитах исследовали по модифицированной методике Э.Н. Коробейниковой [7], диеновых конъюгатов (ДК) - методом В.Б. Гаврилова и М.И. Мишкорудной [4].

Свободные биоорганические радикалы, образующиеся в процессе активации ПОЛ, обладают способностью ХЛ, интенсивность которой зависит от природы и объема накопленных соединений [1, 6].

При развитии ОНМК в плазме крови активируется как спонтанная, так и индуцированная ХЛ, что связано с интенсивным накоплением люминесцирую-щих продуктов, особенно на протяжении 1-й недели инсульта. Как следует из табл. 1, генерация свободных радикалов в плазме крови при ишемическом инсульте на 1-7-е сутки превышает контрольные величины в 2-3 раза. Спустя 15-20 сут концентрация люминесцирующих продуктов в плазме крови начинает снижаться, однако полностью не нормализуется. Аналогичная, но более выраженная картина наблюдается при исследовании ХЛ эритроцитов при геморрагическом инсульте. В этом случае уровень спонтанной ХЛ на 1-7-е сутки повышается почти в 2-4 раза, индуцированной - в 1,5-2 раза. Как видим, в случае ишемического инсульта хотя и сохраняются обнаруженные выше закономерности в динамике ХЛ, однако интенсивность процессов нарастания продуктов сверхслабого свечения в плазме крови ниже (р<0,05), чем при геморрагическом инсульте.

Таблица 1. Уровень спонтанной и Fe2+-индуцированной ХЛ плазмы крови и эритроцитов больных с разными формами ОНМК, имп/3 мин

Срок исследования,сутки Спонтанная ХЛ Индуцированная ХЛ

Плазма крови
Kонтроль 103,6 9,8 2530,6 98,5

Геморрагический инсульт

1-3-и 228,7 11,9^* 2848,5 92,3

5-7-е 312,3 8,8^* 3970,8 125,8*

15-20-е 208,5 21,1^* 3010,5 88,5*

Ишемический инсульт

1-3-и 198,5 31,5^* 2730,8 79,5^*

5-7-е 205,6 17,9^* 2995,4 61,3^*

15-20-е 158,4 12,3 2690,5 19,8

Суспензия эритроцитов
Kонтроль 167,5 19,4 1880,6 82,4

Геморрагический инсульт

1-3-и 293,0 39,5^* 2905,8 115,3^*

5-7-е 572,8 91,3^* 3105,3 128,8^*

15-20-е 215,5 76,0^* 2300,5 91,5^*

Ишемический инсульт

1-3-и 220,8 17,9 2115,6 19,5^*

5-7-е 395,1 21,5^* 2885,7 21,8^*

15-20-е 200,0 12,4 2008,4 13,1

Примечание. Здесь и в табл. 2 звездочкой отмечены достоверные различия с контролем на уровне р<0,05.

Содержание соответствующих липоперекисей в плазме крови представлено в табл. 2. Видно, что при разных формах ОНМК независимо от характера инсульта уже в первые сутки заболевания происходит значительное повышение содержания промежуточных и конечных продуктов ПОЛ по сравнению с контролем. Так, уровень МДА в плазме повышался в среднем на 20-30%, ДК - на 30-40% по отношению к контролю. Аналогичные изменения МДА в эритроцитах отмечались на 5-7-е сутки от момента развития инсульта, особенно у больных с субарахноидальным типом патологии.

Таблица 2. Уровень ДК и МДА в плазме крови больных с разными формами ОНМК

Срок исследования больных,сутки Kонтроль Формы инсульта

геморрагический ишемический

Диеновые конъюгаты, мкмоль/мл

150 13,0

1-3-и - 171 22 187 12

5-7-е - 205 20,0^* 155 11

15-20-е - 195 17,5^* 114 20

Малоновый диальдегид, нмоль/г Hb

42,0 7,0

1-3-и - 57,0 11,0^* 55,0 6,0

5-7-e - 64 5,5^* 60,5 9,2^*

15-20-e - 48 7,0 47,0 10,0

В этот период, характеризующийся усилением процессов ПОЛ, у большинства больных происходило нарастание общемозговых симптомов, формировался вторичный стволовой синдром. Обращает на себя внимание и то обстоятельство, что после проведенного лечения (15-20-е сутки) не во всех случаях наблюдалась нормализация процессов ПОЛ в эритроцитах. Вплоть до 15-20-х суток при субарахноидальном типе геморрагического инсульта уровень ДК превышал норму почти в 2 раза (р<0,05), хотя в плазме крови отмечалась тенденция к его снижению.

В случае ишемического инсульта процессы ПОЛ протекают менее интенсивно. По мере затухания общемозговых процессов после лечения уровень как ДК, так и МДА нормализовался и к 15-20-м суткам достигал контрольных величин.

Свободные радикалы, представленные молекулами с неспаренным электроном на внешней орбите, обладают высокой реактивностью и могут взаимодействовать с липидами, белками или нуклеиновыми кислотами. В результате подобных взаимодействий, которые нередко дают начало автокаталитическим цепным реакциям, возникают деструктивные процессы, в клетках и в плазме крови появляются гетерогенные продукты окисления и деградации биополимеров, известные как МСМ. Действительно, мы обнаружили, что при исследованных формах инсульта в крови почти вдвое возрастает общее содержание МСМ по отношению к тотальному белку плазмы. Максимальное накопление в плазме крови МСМ, как и продуктов ПОЛ, происходит на протяжении первой недели заболевания, постепенно к 15-20-м суткам показатели нормализуются, за исключением фракций D и F (табл. 3).

Таблица 3. Содержание МСМ в плазме крови больных инсультом, %

Срок исследования,сутки МСМ, % от общего белка Фракции пептидов

А ₄ В В₁ С D T F G

Kонтроль

5,3 0,8 0,8 0,03 11,0 0,9 6,0 0,7 57,1 2,3 14,7 2,5 1,5 0,20 1,4 0,23 7,5 0,91

Ишемический инсульт

1-3-и 10,2 0,7 6,1 0,8 11,6 0,8 4,9 0,5 62,9 3,0 16,6 0,9 2,9 0,7 14,1 0,8 7,7 0,5

5-7-е 6,9 0,8 2,3 0,3 9,5 0,7 5,0 0,4 59,8 2,8 13,5 0,7 1,9 0,3 8,5 0,7 7,2 0,5

15-20-е 7,9 0,6 2,4 0,7 9,5 0,9 5,2 0,2 60,3 3,1 14,2 0,8 2,1 0,3 9,5 0,8 8,2 0,7

Геморрагический инсульт

1-3-и 9,1 0,7 3,0 0,6 13,4 0,8 4,5 0,7 51,8 2,0 23,7 1,8 2,2 0,7 12,1 0,8 6,2 0,7

5-7-е 9,6 0,5 3,6 0,2 12,4 0,9 5,5 0,5 59,4 3,0 25,5 1,7 2,5 0,3 12,1 0,2 6,7 0,3

15-20-е 8,3 0,8 2,3 0,3 11,4 0,9 7,2 0,5 56,7 3,5 22,5 1,3 1,6 0,5 3,2 0,8 6,7 0,7

Сравнение кривых фракционирования плазмы крови (см. рис. 1) при ОНМК и у здоровых лиц обнаружило, что у больных геморрагическим инсультом происходит значительное увеличение фракций А и с мол. м.> 7600 и 5100 Да, фракции D c мол. м. А 4 3100 Да, фракции F с мол. м. 2600 Да и в меньшей степени фракции В с мол. м. 4200 Да. При этом наблюдалась тенденция (р>0,05) к снижению в крови уровня МСМ с мол. м. 3700 и 2400 Да. Следовательно, при развитии инсульта в плазме крови происходит определенное концентрационное перераспределение МСМ, которое может быть характерным только для данного вида патологии.

Рис.1 Типичная хроматограмма плазмы крови здорового донора (а) и больного с геморрагическим инсультом (б).

Таким образом, наблюдается определенный параллелизм между накоплением МСМ в крови больных инсультом и индукцией процессов ПОЛ, которые могут быть фактором генерации МСМ.

В одной из работ [15] показано, что при искусственной стимуляции в клетках процессов ПОЛ в крови появляются МСМ, характеризующиеся поглощением при длине волны 254 нм, которые относятся к молекулам, содержащим неароматические аминокислоты. Считается, что появление и накопление МСМ в крови при разных видах патологии является прогностически неблагоприятным показателем, так как продукты деградации биополимеров и их комплексов могут оказывать выраженное нейротоксическое влияние на структуры головного мозга [10].

На самом деле биологическая роль МСМ в физиологических и особенно патологических процессах не до конца ясна. Например, показано [13], что парентеральное введение модифицированных лиофилизацией МСМ изменяет скорость процессов ПОЛ в органах экспериментальных животных с ожоговой травмой. В частности, под влиянием экзогенных МСМ резко снижается интенсивность ПОЛ в ткани мозга, что рассматривается как фактор нормализации взаимодействия нейрональных рецепторов и нейротрансмиттеров. Поэтому считают [11, 14], что действие МСМ на ПОЛ носит <регуляторный> характер и направлено на поддержание пероксидации структур клеток на определенном уровне. По всей видимости, в состав МСМ, кроме веществ, обладающих эндотоксическими свойствами, входят также продукты, выступающие в роли клеточных регуляторов или модуляторов иммунных процессов [5].

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что накопление МСМ определенных классов в крови при инсультах связано с параллельно протекающими процессами ПОЛ, которые определяют глубину вторичных патохимических изменений в тканях головного мозга. Это следует учитывать при разработке методов медикаментозного лечения и оценке прогноза заболевания.

Журнал неврологии и психиатрии N1-2000, стр.48-51

Литература

1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М: Наука 1972.

2. Габриэлян Э.С., Акопов С.Э., Ерзинкян С.М. и др. Физиологическая активность плазмы крови при церебральных дисгемиях. Сов мед 1987; 5: 14-16.

3. Габриэлян Н.И., Дмитриев А.А., Савостьянова О.А. и др. Средние молекулы и уровень эндогенной интоксикации у реанимационных больных. Анестезиол и реаниматол 1985; 1: 36-38.

4. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое оп-ределение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови. Лечебное дело 1983; 3: 33-36.

5. Галактионов С.Г., Цейтин М.М., Леонова В.И. и др. Пептиды группы <средних молекул>. Биоорган химия 1984; 10: 1: 5-7.

6. Журавлев А.И. Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии. М: Наука 1982.

7. Коробейникова Э.Н. Модификация определения продуктов перекисного окисления липидов в реакции с тиобарбитуровой кислотой. Лаб дело 1989; 7: 8-9.

8. Николайчик В.В., Федулов А.Г., Бычко Г.Н. и др. Влияние пептидов на осмотическую устойчивость эритроцитов. Труды III Всесоюзн. межунив. конф. физ.-хим. биол. Тбилиси 1982; 2: 364-365.

9. Парфенова Г.А., Чернядыва И.Ф., Ситина В.К. Средние молекулы - маркер эндогенной интоксикации. Врач дело 1987; 4: 72-77.

10. Пирадов М.А., Левченко Н.И., Габриэлян Н.И. и др. Сравнительная оценка эффективности методов определения осмоляльности и средних молекул в прогнозе течения инсультов. Лаб дело 1990; 5: 10-12.

11. Рябинин В.Е. Изучение функционального состояния митохонд-рий в период ранней ожоговой токсемии и при воздействии токсических пептидов крови: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Челябинск 1979.

12. Тупикова З.А. Среднемолекулярные уремические токсины. Вопр мед химии 1983; 29: 1: 2-10.

13. Тупикова З.А. Влияние молекул средней массы, выделенных из сыворотки крови обожженных, на процессы перекисного окисления липидов. Вопр мед химии 1983; 3: 108.

14. Тупикова З.А. Влияние молекул средней массы, выделенных из сыворотки крови обожженных пациентов, на состояние процессов перекисного окисления липидов в тканях животных. Вопр мед химии 1990; 36: 3: 24-26.

15. Чаленко В.В. Возможные причины повышения концентрации молекул средней массы при патологии. Пат физиол 1991; 4: 13-14.

16. Шепилова Ж.И., Балякин С.О. Диагностическое значение определения средних молекул при некоторых деструктивных патологических процессах. Лаб дело 1984; 9: 546-548.

17. Шиманко И.И., Габриэлян Н.И., Милашенко А.П. Оценка токсичности сред организма при острой эндогенной патологии. Тер арх 1982; 9: 8-11.

18. Шмидт Е.В. Классификация сосудистых поражений головного и спинного мозга. Журн невропатол и психиатр 1985; 85: 9: 1281-1292.

Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова

Написать комментарий