Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Биология >> Молекулярная биология | Дипломные работы
 Посмотреть комментарии[1]  Добавить новое сообщение
Александров И. М. Шапероны и прионы: регуляция конформационный состояний прионного белка дрожжей SUP35

Курсовая работа студента 4-го курса кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ. Москва, 2001
Авторские права сохранены. Любое копирование данного текста и/или его фрагментов без разрешения автора запрещено и преследуется в соответствии с действующим законодательством РФ.

Содержание   В начало...
 
 


3.2 Образование de novo

Одним из наиболее удивительных свойств дрожжевых прионов является обратимость их потери: они могут возникать de novo у штаммов, которые их утратили или никогда не имели. Клетка, лишившаяся прионного детерминанта, может снова приобрести его с некоторой вероятностью, если только не произошла мутация в гене, кодирующем прионный белок [9].

При этом образование de novo детерминанта [Psi+] регулируется другим прионным детерминантом [Pin]. [Pin] определяет, будет ли образовываться [Psi+] de novo. Если клетки имеют детерминант [Pin-], то [Psi+] de novo не образуется. Однако, если белок Sup35 укорочен с С-конца, то [Pin] на [Psi+] никак не влияет [31].

Укороченный с С-конца белок Sup35 сильно увеличивал частоту конверсии de novo [8]. То же самое происходило и с Ure2 [40]. Было показано, что чем меньше фрагмент, несущий прионообразующий домен, тем выше частота конверсии [8].

Также было показано, что при увеличении в клетке концентрации белка Sup35 в нормальной конформации повышается вероятность конверсии de novo [41]. Такие же свойства проявляет и белок Ure2. При нормальной экспрессии и длине белка образование прионной конформации de novo происходит крайне редко. Однако при сверхэкспрессии эта частота резко увеличивается. Можно предложить следующие объяснения:

1. Более частая конверсия обусловлена просто увеличением концентрации белка.

2. На правильную укладку всего сверхпродуцированного белка может не хватать шаперонов, в результате чего образуется неправильно уложенная форма белка, что повышает вероятность появления прионной конформации.

3. Если шаперон не успевает укладывать весь белок правильно, протеазы могут частично разрезать его, оставляя укороченные домены, которые с большей вероятностью образуют прионную конформацию de novo.

Два последних предположения сводятся к тому, что прион как бы титрует шаперон [лекции Тер-Аванесян]. Возможно, все три эти объяснения правильны и взаимосвязаны. В дополнение можно сказать, что связь шаперонов с конверсией de novo косвенно подтверждается тем, что при делеции шаперона Ssb1 частота формирования спонтанного образования [Psi+] возрастает (см. ниже [12]).

3.3 Обратная конверсия

Интересной особенностью дрожжевых прионов является обратная конверсия, т.е. возможность исчезновения прионного детерминанта и приобретение нормальной, функционирующей формы белка, не образующей агрегаты.

Поддержание детерминанта [Psi+] клетками дрожжей зависит от концентрации шаперона Hsp104, причем эта зависимость на фенотипическом уровне носит удивительный характер: как полное отсутствие шаперона, так и его сверхэкспрессия приводит к элиминации [Psi+] [28]. Видимо для существования детерминанта нужен некоторый оптимальный уровень концентрации Hsp104 [9]. Однако, сверхэкспрессия Hsp104 не элиминирует детерминанты [URE3] [36] и [Pin] [31].

Рассмотрим действие Hsp104 на молекулярном уровне. Одной из функций этого шаперона является разрушение частично денатурированных белков, образующих агрегаты. Анализ последствий сверхэкспрессии показывает, что увеличение внутриклеточной концентрации Hsp104 приводит к разрушению агрегатов и накоплению растворимой формы Sup35. Видимо при элиминации [Psi+] происходит полное разрушение агрегатов Sup35 [9].

Делеция гена Hsp104 элиминирует детерминант. Для объяснения этого факта существуют две гипотезы. Агрегаты прионных белков представляют собой фибриллы. Тер-Аванесян с сотрудниками предположили, что Hsp104 действует на прионные фибриллы Sup35 так же, как и на другие белковые агрегаты. При этом происходит фрагментация фибрилл, сопровождающаяся увеличением количества концов, по которым происходит полимеризация (конверсия). Следовательно, частичное разрушение фибрилл увеличивает общую скорость полимеризации. Кроме этого фрагментация необходима для стабильного наследования детерминанта, когда отрезки фибрилл переходят в дочерние клетки. При отсутствии шаперона фрагментация происходить не будет, поэтому белок Sup35 будет находиться в клетке в виде одного агрегата - единственного центра полимеризации; он будет медленно осуществлять конверсию, и, возможно, не будет разделен между дочерними клетками. В таких условиях наследование [Psi+] будет затруднено и через некоторое время прионный фенотип исчезнет [4].

Существует и другое объяснение, предложенное Линдквист с сотрудниками, согласно которому шаперон Hsp104 участвует в самом S/A переходе. Соответственно, когда его нет, то [Psi+] просто не образуется. Здесь можно различать две возможности:

1. Hsp104 необходим для предварительной укладки белка в "компетентную" S-форму, способную к S/A переходу.

2. Hsp104 прямо катализирует и прямой и обратный S/A переходы, сборку и разборку агрегатов соответственно. Уровень, на котором устанавливается равновесие зависит от концентрации Hsp104. Например, сверхэкспрессия сдвигает равновесие в сторону разборки агрегатов.

Также существуют некоторые мутации в белке Sup35, которые "вылечивают" клетки от детерминанта [Psi+]. Была исследована мутация PNM2, которая меняет Gly58 на Asp и элиминирует детерминант [Psi+]. Такой мутантный белок Sup35 имеет прионные свойства и так же эффективно встраивается в агрегат, как и дикий тип. Однако, было показано, что такой агрегат медленнее осуществляет конверсию белка как мутантного, так и нормального. Таким образом мутантные молекулы Sup35 могли эффективно конкурировать с нормальным за встраивание в агрегат, и уже включившись замедлять прионную полимеризацию белка. Это могло быть связано с тем, что мутантный белок имеет в целом другую конформацию или/и с тем, что у мутанта конец, которым он присоединяется к агрегату никак не затронут, а конец, по которому происходит дальнейшая полимеризация изменен и присоединение последующей молекулы Sup35 может быть затруднено [10]. Вероятно, эта мутация является элиминирующей, из-за того, что скорость роста агрегатов не поспевает за делением клеток дрожжей и, следовательно, в ряду поколений клеток с некоторой частотой прионные агрегаты теряются. Похожие случаи были выявлены и у млекопитающих. Одновременное присутствие различных вариантов белка PrP нарушало конверсию PrPC в его прионную изоформу (PrPSc) [10].

"Вылечивающее" действие на прионы млекопитающих оказывают и так называемые химические шапероны. Уже было сказано, что GuHCl - белок денатурирующий агент, элиминирует прионный детерминант. Возможно, он нарушает стабильную конформацию прионного агрегата и он приобретает (по гипотезе Линдквист) свойства растворимого олигомера с плохо замороженной конформацией и разрушается. Существует и другая возможность. Было показано, что рост клеток на GuHCl индуцировал экспрессию Hsp104, что может служить причиной элиминации [Psi+]. Однако это не согласуется с тем, что GuHCl также элиминирует детерминанты [URE3] [37] и [Pin] [31], которые, как уже говорилось, не "излечиваются" шапероном Hsp104. Было показано, что химические шапероны уменьшают скорость конверсии белка PrPC в PrPSc , но не оказывают никакого эффекта на предсуществовавший PrPSc. Предполагается, что химические шапероны стабилизируют альфа-спиральные участки PrPC . Диметилсульфоксид (DMSO) в средних концентрациях (1-3%) увеличивает конверсию нормального белка в инфекционный в 2-3 раза, при добавлении к нормальному белку "семян" PrPSc (дополнительно обработанных денатурирующими агентами в малых количествах), однако он полностью ингибирует ее при больших концентрациях (до 30%). Возможно в первом случае DMSO слегка ограничивает конформационную подвижность, а его большие концентрации просто денатурируют белок. На сегодняшний день непонятно, почему предварительная слабая денатурация семян помогает конверсии. Сахароза и трехалоза ингибировали конверсию только в больших концентрациях (1000мМ). Такие концентрации в норме в клетке не наблюдаются, но могут достигаться локально при стрессовых условиях [2].

Далее...


Посмотреть комментарии[1]
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования