Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Посетите Сервер по Физике Обратите внимание!
 
  Наука >> Физика >> Специальные разделы >> Биофизика | Обзорные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Биофизические методы в экологическом мониторинге
А. Б. РУБИН
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова


Хорошо известно, какое значение в современных условиях сильного антропогенного воздействия на внешнюю среду имеет экологический мониторинг. Его успешное проведение должно позволить прогнозировать изменение характеристик отдельных звеньев экологической системыи на основании этого предсказать дальнейшую эволюцию экосистемы во времени. Принципиальное значение в этом отношении имеет получение экспресс-информации состояния клеток организмов в результате различных внешних воздействий. Имеется в виду информация, которая позволила бы уже на ранних этапах диагностировать изменение клеточного метаболизма под влиянием внешних факторов. Принципиально важно получить эту информацию задолго до того, как результат внешних воздействий на организмы проявится в видимых признаках, таких, как изменение формы и задержка роста клеток, уменьшение численности клеточной популяции и общей биомассы. Конечно, эти признаки также важны для характеристики состояния как отдельных звеньев, так и экосистемы в целом. Однако на основании их изменения можно констатировать лишь конечный эффект оказанного воздействия, результат того, что уже произошло. Такие признаки могут служить источником информации для ранней диагностики нарушения состояния клетки при внешних воздействиях. Отвечающие этим требованиям современные биофизические методы экспресс-диагностики состояния клеток основаны на регистрации начальных нарушений клеточного метаболизма в основном на мембранном уровне организации клетки.


Оптические методы. Наибольшее развитие в последние годы получили различные спектральные и люминесцентные методы, которые используются главным образом для диагностики состояния клеток микроводорослей под влиянием факторов среды в водных экосистемах. В природных водоемах различные антропогенные загрязнения могут оказать существенное угнетающее влияние на фотосинтетический аппарат водорослей, что в итоге уменьшает продуктивность всей водной экологической системы. Регистрация действия внешних факторов на состояние фотосинтетических мембран клеток микроводорослей позволяет тем самым следить и за состоянием водной среды.
Основная идея такого подхода состоит в том, что хлорофилл, находящийся в фотосинтетических мембранах, служит своего рода природным датчиком состояния клеток водорослей и высших растений. При нарушении состояния фотосинтетических мембран под действием внешнего фактора происходят определенные изменения оптических свойств хлорофилла, которые и служат источником информации для экспресс-диагностики состояния клеток. Этому обстоятельству способствует то, что в фотосинтетическом аппарате фотосистема II, ответственная за разложение воды и выделение кислорода, является чувствительной мишенью для таких внешних факторов, как экстремальные температуры, избыточная освещенность, соли тяжелых металлов, высушивание, повышение содержания солей в питательной среде.
Сейчас во многих лабораториях, занимающихся разработкой новых методов экологического мониторинга, в том числе в водоемах, это направление интенсивно развивается. Несомненно, ему принадлежит большое будущее, поскольку оно обеспечивает раннюю экспресс-диагностику состояния клеток в природных условиях. Мы познакомимся кратко, не вдаваясь детально в механизмы фотосинтеза, с научными основами и применением в природных условиях люминесцентных методов диагностики состояния клеток микроводорослей и высших растений. Отметим вначале, что спектральные методы в экологических исследованиях применяются уже давно. Известно, например, что по изменению оптических свойств растительного покрова путем их регистрации с помощью искусственных спутников Земли можно судить о состоянии растительных массивов. Например, продолжительные воздействия недостатка влаги, засухи, засоленность почв приводят к характерным изменениям спектров поглощения хлорофилла листового покрова и позволяют сделать вывод о неблагополучном состоянии растений. Однако эти эффекты наблюдаются через значительные промежутки времени, когда нарушения состояния растений уже произошли и стали, как правило, необратимыми. В отличие от этого предлагаемые люминесцентные методы отражают такие изменения в фотосинтетическом аппарате, которые происходят на самых начальных этапах внешнего воздействия.
Дело в том, что первичные стадии фотосинтеза водорослей при действии факторов внешней среды не остаются неизменными, а активно регулируются клеткой в соответствии с ее физиологическим состоянием [2, 7, 9, 10]. Цель этой регуляции заключается в оптимальном сопряжении световых и темновых стадий фотосинтеза, необходимом для поддержания определенного уровня метаболизма в измененных внешних условиях.


Флуоресценция хлорофилла. Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток. Для понимания этой взаимосвязи достаточно напомнить, что поглощение кванта света переводит молекулу хлорофилла в электронное возбужденное состояние, энергия которого в растворе при отсутствии фотосинтеза переходит либо в тепло, либо в флуоресценцию. В фотосинтетической мембране энергия электронного возбуждения хлорофилла используется в реакционных центрах (РЦ) для генерации потока электронов в первичных стадиях фотосинтеза, необходимых для восстановления НАДФ и образования АТФ. Напомним, что первичные процессы фотосинтеза высших растений осуществляются при участии двух фотосистем, функционирующих последовательно. Фотосистема II разлагает воду с выделением свободного кислорода и отдает электрон через цепь переносчиков на фотосистему I, которая уже восстанавливает НАДФ (подробнее см. [4, 7]). В клетке в основном флуоресцирует хлорофилл, принадлежащий фотосистеме II, и именно изменения его флуоресценции говорят о состоянии реакционных центров этой фотосистемы. При активном фотосинтезе, когда все РЦ находятся в открытом рабочем состоянии, в условиях слабого освещения почти вся поглощенная энергия света используется в процессе фотосинтеза. Поэтому интенсивность флуоресценции хлорофилла в клетке намного ниже, чем в растворе (рис. 1).
Однако и здесь небольшая часть энергии электронного возбуждения (не более 3%) переходит в энергию света флуоресценции в виде так называемой фоновой флуоресценции F0 . Как правило, в нормальных условиях величина F0 мала, что говорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. Но если при каких-либо воздействиях нарушается состояние фотосинтетических мембран, то центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние, когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза. В этих условиях поглощенная энергия света уже не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает. Можно полностью вывести из рабочего состояния РЦ, например при действии ингибитора потока электронов диурона [4, 7]. В этом случае флуоресценция сильно возрастает и приближается к своим максимальным значениям Fm . Заметим, что закрыть центры можно создавая также избыточную освещенность клеток, когда происходит световое насыщение фотосинтеза. Фотосинтетическая цепь переноса электрона как бы захлебывается от избытка поглощенной световой энергии, переводя все большую часть поглощенной энергии света в флуоресценцию.
Можно найти разницу между интенсивностями флуоресценции хлорофилла при закрытых и открытых РЦ (Fv = Fm - F0), которую называют переменной флуоресценцией (Fv) хлорофилла в клетках (см. рис. 1). Как видно, величина Fv соответствует той части энергии света, которая используется открытыми реакционными центрами в фотосинтезе, то есть может характеризовать активность начальных стадий фотосинтеза. На практике оценивают отношение Fv / Fm , величина которого тесно связана с первичной продуктивностью фитопланктона в природных водоемах. Она хорошо коррелирует с фотосинтетической продукцией клеток, определенной классическими методами по восстановлению СО2 с помощью радиоактивных изотопов 14 С.

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая конверсию энергии света в фотосистеме II с образованием АТФ и восстановлением НАДФ. РЦ - реакционный центр фотосистемы II. Флуоресценция F0 и Fm при активных и неактивных реакционных центрах фотосистемы II соответственно.
Справа - изменение флуоресценции во времени при закрытии центров (переход F0 Fm). Пунктирная линия отражает изменение флуоресценции в присутствии диурона (ДСМИ)

Флуоресценция фитопланктона. Для исследования флуоресценции фитопланктона в природных водоемах на кафедре биофизики биологического факультета МГУ разработан специальный прибор (погружной зонд-флуориметр), позволяющий проводить измерение величин F0 и Fm в водоемах на разных глубинах (до 200 м). Принцип действия зонда представлен на схеме (рис. 2). При освещении первой слабой вспышкой света порции фитопланктона в зонде измеряется величина фоновой флуоресценции F0 . Затем при действии второй мощной вспышки света в клетках происходит кратковременное насыщение всех РЦ, которые не успевают утилизировать поглощенную энергию света и переходят в результате этого в закрытое состояние. В этих условиях флуоресценция хлорофилла возрастает до максимальных значений Fm . Таким образом можно определить значения переменной флуоресценции Fv = Fm - F0 и отношение Fv / Fm , которые отражают эффективность запасания энергии света на начальных этапах фотосинтеза.
Поскольку величина F0 зависит от количества хлорофилла в клетках, то это можно использовать для определения его концентрации. По величине F0 можно также определять и количество биомассы фитопланктона, которое пропорционально содержанию хлорофилла в клетках. Определение величин F0 и Fv / Fm позволяет выявить ситуации, когда в водоемах имеется много фитопланктона (F0 велико), однако его активность и продукция невелика из-за неблагоприятных условий. На основании этих данных можно получить сравнительную информацию о распределении как самого фитопланктона (F0), так и его фотосинтетической активности (Fv / Fm) по глубине и горизонтальным разрезам в водоемах и рассчитать фотосинтетическую продукцию. На рис. 2 приведен профиль распределения фитопланктона и его активности по глубине.
Замедленная флуоресценция. Другим источником информации о характере функционирования фотосинтетического аппарата является процесс замедленной флуоресценции (ЗФ), обнаруженный Арноном и Стреллером в 1951 году. Это явление состоит в том, что после светового возбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое, длительно затухающее свечение, испускаемое хлорофиллом. Это свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (F0) за счет энергии, выделяемой в ходе темновых реакций первичных фотопродуктов фотосинтеза в РЦ (рис. 3).

Рис. 2. Схема морского зондирования фитопланктона с использованием погружного двухимпульсного флуориметра. Справа показаны результаты изменения на разной глубине количества (F0), фотосинтетической активности (Fv / Fm) и температуры
(Т ) водной среды. Видно, что наибольшее количество и активность клеток наблюдаются на глубине 50 м. В поверхностных слоях фотосинтез угнетается из-за слишком больших интенсивностей солнечного света

Рассмотрим упрощенную схему этого процесса. В РЦ при поглощения кванта света (hv) возбуждается молекула хлорофилла реакционного центра Р (P P*). Затем происходит переход электрона от P* на первичный акцептор электрона A1 (восстановление первичного акцептора электронов А1-> P*A1-> P + A1-. Это одновременно сопровождается окислением фотоактивного хлорофилла РЦ (Р) (см. рис. 3):
PA1 -> P*A1-> P+A1-.
Затем электрон уходит от акцептора A1-дальше в цепь переносчиков и в итоге попадает на окисленную молекулу НАДФ+. Окисленный РЦ ФСII (P+), в свою очередь, восстанавливается за счет электрона, полученного при разложении воды. Эти этапы ответственны за генерацию первичного прямого потока электронов (см. рис. 1).
Однако существует небольшая вероятность обратного переноса электрона в РЦ от A1-к P+, при котором происходит его рекомбинация с P+ с регенерацией возбужденного состояния Р*. В результате этого клетки испускают замедленное свечение с некоторой задержкой во времени
P* Р + hv.

 

Рис. 3. Схема возникновения замедленной флуоресценции хлорофилла листьев и водорослей при возвращении от A1-на P.
- прямой перенос электрона P*A1 P+A1-.
- обратный перенос электрона P+A1- P*A1 P + hv, сопровождающийся замедленной флуоресценцией.
1 - Сигналы замедленной флуоресценции: а - листьев гороха (нормальное растение (1 ) и мутант с нарушениями в реакционном центре фотосистемы II (2 ); б - зеленой водоросли хлорелла: контроль (1 ) и при действии загрязнений CuSO4 (2 ). Видно, что воздействия, влияющие на реакционный центр фотосистемы II, ингибируют замедленную флуоресценцию


Очевидно, интенсивность ЗФ пропорциональна количеству РЦ в состоянии Р+А1-с разделенными зарядами. Это состояние зависит от скорости последующих стадий переноса электрона. При действии повреждающих факторов на фотосинтетический аппарат концентрация РЦ в состоянии Р+А1-может изменяться. Это позволяет использовать ЗФ для обнаружения загрязнений в водной среде (рис. 3, а, б, кривые 2 ). Кроме того, оказалось, что интенсивность ЗФ увеличивается за счет энергии трансмембранного электрохимического потенциала на мембранах хлоропластов, необходимого для синтеза молекул АТФ [4]. Это также позволило использовать метод ЗФ для оценки степени энергизации мембраны хлоропластов и связанной с ней фотосинтетической продуктивности фитопланктона.

Хемилюминесценция хлорофилла и перекисное окисление липидов. Для получения информации о процессах разрушения клеточных мембран используется также хемилюминесценция молекул хлорофилла. Известно, что действие неблагоприятных факторов может нарушать состояние липидовклеточных мембран и активировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1, 3, 5]. Ускорение перекисного окисления является универсальной ответной реакцией клеток на действие неблагоприятных факторов внешней среды. В частности, уровень продуктов ПОЛ резко увеличивается в растительных клетках при холодовом и тепловом шоке и интенсивном освещении.
Факторами, способствующими развитию ПОЛ, являются активные формы кислорода. Активные формы кислорода: электронно-возбужденный синглетный кислород О2 и анион-радикал или супероксид-радикал кислорода О2 - могут образовываться в фотосинтетических мембранах за счет энергии возбужденного фотоактивного хлорофилла P* и электронов в цепи фотосинтеза [3, 11].
При повышенной освещенности клеток, а также при повреждении состояния фотосинтетических мембран и нарушении сопряжения световых и темновых стадий фотосинтеза создается избыток неиспользуемой энергии электронного возбуждения хлорофилла и электронов в цепи переносчиков электронов. Это и способствует генерации активных форм кислорода и ПОЛ. В фотосинтетических мембранах в процессах ПОЛ образуются гидроперекиси липидов, концентрация которых служит показателем нарушения состояния клеточных мембран. Распад гидроперекисей происходит с образованием электронно-возбужденных химических продуктов карбонильной природы. Их способность с высокой эффективностью передавать энергию возбуждения на хлорофилл приводит к медленно затухающей хемилюминесценции хлорофилла. Это обстоятельство и позволило разработать люминесцентный метод регистрации продуктов ПОЛ в клетках фотосинтезирующих организмов.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования