В начало...

Молекулярные моторы. Часть 1. Вращающиеся моторы живой клетки. А. Н. ТИХОНОВ. Продолжение

Ротор и статор АТРсинтазы
Представления об АТРсинтазе как молекулярной машине, работа которой связана с ее вращением, хорошо согласуются со структурными особенностями АТРсинтазы, в которой можно выделить две группы белковых субъединиц. Одна из них образует статор мотора, который неподвижен относительно мембраны, а другая соответствует подвижному ротору, вращающемуся внутри статора (рис. 2, Б ).
Статор включает в себя шарообразный гексамер, образованный тремя субъединицами и тремя субъединицами , находящуюся на его поверхности субъединицу d, а также субъединицы a и b мембранного комплекса F₀ . В этой макромолекулярной конструкции субъединицы b выполняют роль своеобразного кронштейна, связывающего неподвижные субъединицы комплексов F₀ и F₁ . К находящейся в мембране субъединице a примыкает гидрофобное кольцо, образованное субъединицами с мембранного комплекса F₀ .
Ротор состоит из субъединиц и комплекса F₁ . Субъединица , расположенная внутри комплекса ()₃ , заметно выступает из него и соединяется с погруженным в мембрану кольцом из субъединиц с. Имеются все основания считать, что субъединица , входящая в состав ротора, действительно вращается при работе фермента.
Вопрос о том, в состав какого функционального узла АТРсинтазы, статора или ротора, входят субъединицы с, является спорным. Некоторые исследователи полагают, что субъединица жестко сцеплена с кольцом из субъединиц с и во время работы АТРсинтазы кольцо из субъединиц с вращается, подобно маховому колесу, вместе с субъединицами и . Однако прямые экспериментальные доказательства этой гипотезы пока отсутствуют.
В последнее время появились убедительные данные о том, что каталитическая активность АТРсинтазы непосредственно связана с вращением ее ротора. Считается, что поворот субъединицы вызывает одновременное изменение конформации всех трех каталитических субъединиц , что в конечном итоге обеспечивает работу фермента [4]. Вращение субъединицы облегчается наличием своеобразной смазки в местах ее контакта с субъединицами и . Это обусловлено тем, что центральная часть субъединицы , находящаяся внутри ансамбля ()₃ , гидрофобна - она не содержит заряженных групп, взаимодействие которых с зарядами субъединиц и могло бы создавать дополнительное трение, препятствующее вращению субъединицы . Однако сама по себе субъединица не может свободно вращаться внутри комплекса ₃₃ (за счет энергии тепловых движений). Свободному вращению ротора препятствуют стерические ограничения - субъединица , вращающаяся вместе с субъединицей , зацепляется за неровности внутри полости, образованной субъединицами a и b. Поэтому для того, чтобы провернуть ротор внутри статор, и тем самым заставить АТРсинтазу сделать молекулу АТР, необходим внешний источник энергии. Как уже было сказано выше, когда АТРсинтаза работает в режиме синтеза АТР (рис. 1, а), движущей силой для ее работы является энергия ионов водорода, переносимых через сопрягающую мембрану за счет протонного потенциала. При работе АТРсинтазы в режиме гидролиза АТР (рис. 1, б ) источником энергии для вращения ротора служит энергия, запасенная в молекуле АТР.

Как доказали, что молекулярный мотор может вращаться
Существуют ли экспериментальные доказательства того, что работа протонных АТРсинтаз действительно связана с направленным вращением ее отдельных частей? Можно ли непосредственно увидеть вращение ротора молекулярной машины столь малого размера, какой является АТРсинтаза? Многие годы эти вопросы были предметом оживленных дискуссий среди биоэнергетиков, и лишь в последнее время на них получены утвердительные ответы. Наглядно показано, что гидролиз АТР комплексом F₁ действительно сопровождается вращением субъединицы относительно гексамера ()₃ . Это значит, что АТРсинтаза является молекулярной машиной, про которую можно с уверенностью сказать: "Все-таки она вертится!" Рассмотрим, как это было доказано.

Рис. 3. Схемы, иллюстрирующие способы доказательства того, что субъединица АТРсинтазы вращается: А - изменение положения дисульфидного мостика (S-S) в результате поворотов субъединицы внутри центральной полости комплекса F1 ; Б - вращение актинового хвоста, прикрепленного к концу субъединицы молекулы F1 , которая отделена от мембраны и зафиксирована на подложке с помощью специальных хвостиков

В работах американских биохимиков Капальди, Кросса и их сотрудников для доказательства вращения субъединицы был использован оригинальный подход, основанный на применении искусственных химических сшивок между субъединицами и с помощью дисульфидных (S-S) мостиков (рис. 3, А ). Методами молекулярной генетики субъединицы и удалось модифицировать так, что в нужные участки полипептидных цепей этих белков были вставлены аминокислоты (цистеины), которые содержат сульфгидрильные группы (-SH). Между этими группами может образоваться ковалентная связь (-SH + HS-S-S-). Таким способом удалось пришить субъединицу љ к субъединице и тем самым блокировать возможное вращение субъединицы внутри комплекса F₁ . Как показали опыты, ферментативная активность комплекса F₁ (его способность гидролизовать АТР) при этом была полностью подавлена. Представим теперь, что после того, как сшивка между субъединицами и была сделана, S-S-мостик разрывают, а затем спустя некоторое время делают новую сшивку. За положением старых и новых мостиков в молекуле F₁ можно следить с помощью меченых (радиоактивных) атомов. Понятно, что в случае покоящейся субъединицы после повторной сшивки S-S-мостик останется в исходном положении. Однако в том случае, если после разрыва S-S-мостика в ходе работы фермента произойдет поворот субъединицы , то может образоваться новый S-S-мостик между субъединицей и другой субъединицей b. Именно такую картину и наблюдали исследователи, когда фермент работал, то есть гидролизовал АТР. Оказалось, что новые S-S-мостики образовывались между субъединицей и всеми тремя субъединицами b фактора сопряжения F₁ (рис. 3, А ); этот факт свидетельствует о вращении субъединицы во время работы F₁ . Показано также, что вращение ротора АТРсинтазы происходит не только при гидролизе АТР изолированным фактором F₁ , но и в условиях синтеза АТР мембранной АТРсинтазой в нативных системах.
В работах немецкого биофизика В. Юнге и его сотрудников для регистрации вращательного движения субъединицы был использован оптический метод, который позволяет изучать подвижность специальной химической метки, присоединенной к субъединице . В качестве молекулярного зонда, сигнализирующего экспериментатору о вращении субъединицы , был использован краситель эозин. Молекулу красителя химическим способом пришивали к субъединице , в то время как саму глобулу ()₃ обездвиживали, прикрепляя ее к ионообменной смоле. За изменением ориентации молекул красителя наблюдали с помощью зондирующего луча поляризованного лазерного света. Обнаружено, что характерное время изменения ориентации молекулы зонда, жестко пришитой к субъединице , составляет ~100 мс, что практически совпадает со временем гидролиза одной молекулы АТР изолированным ферментом. Важно отметить, что вращение субъединицы наблюдается только в случае работающего фермента, то есть когда белковый комплекс F₁ гидролизует АТР. В присутствии ингибитора, препятствующего гидролизу АТР, вращения не происходит.
Однако самым впечатляющим доказательством того, что субъединица действительно крутится в ходе работы фермента, стала замечательная работа, выполненная недавно группой японских исследователей [5, 6]. Киношите, Йошиде и их соавторам впервые удалось непосредственно увидеть вращение субъединицы с помощью флуоресцентного микроскопа. Как можно разглядеть вращение ротора, диаметр которого составляет всего лишь 1љнм ?
Чтобы наблюдать за вращением субъединицы , к ее основанию, выступающему из комплекса F₁ , японские ученые прикрепили специальный макромолекулярный маркер - фрагмент нити актина (белок, входящий в состав мышц) длиной около одного микрона, который, в свою очередь, был помечен молекулами флуоресцирующего красителя. Остальную часть отделенной от мембраны молекулы F₁ обездвижили, пришив к субъединицам специальные хвостики, с помощью которых F₁ прикрепили к неподвижной подложке (рис. 3, Б ). Наблюдая с помощью микроскопа за изменением положения флуоресцирующей нити актина, жестко связанной субъединицей , удалось непосредственно увидеть ее вращение! Оказалось, что в ходе работы фермента, гидролизующего АТР, актиновый хвост крутится против часовой стрелки!! Крутится именно в том направлении, которое было предсказано на основании структурных данных, полученных группой Дж.љУокера!!! Так впервые было наглядно продемонстрировано вращение самого маленького из всех известных в природе моторов. Вместе с этим в науке окончательно утвердилось новое понятие - вращательный катализ (англ. - rotary catalysis). Вращение актинового хвоста молекулой F₁ было снято на пленку и произвело сильнейшее впечатление на всех, кому посчастливилось увидеть видеофильм о работе этого удивительно красивого, необычного и очень важного молекулярного мотора.
В дальнейшем было показано, что молекула F₁ вращает актиновый хвост дискретными скачками с шагом, равным 120њ [6]. Один скачок на 120њ сопровождается гидролизом одной молекулы АТР. При этом средняя скорость вращения мотора зависит от нагрузки: чем длиннее актиновый хвост, тем больше гидродинамическое сопротивление и соответственно тем реже происходят скачкообразные повороты. Иными словами, чем выше нагрузка, тем медленнее крутится мотор. При отсутствии источника энергии (когда система не содержала молекул АТР) регулярного направленного вращения субъединицы не происходило, а наблюдались лишь очень редкие случайные повороты в обоих направлениях, обусловленные тепловыми движениями.
Замечательным качеством вращающегося мотора АТРсинтазы является его исключительно высокий коэффициент полезного действия (КПД). Показано, что работа, которую совершает мотор при повороте актинового хвоста на 120њ, почти в точности равна энергии, запасенной в молекуле АТР. Это означает, что КПД работы мотора близок к 100%.

В табл. 1 приведены сравнительные характеристики различных молекулярных моторов, встречающихся в живой клетке. Видно, что АТРсинтаза является своего рода рекордсменом среди молекулярных моторов своей "весовой категории". По эффективности работы и развиваемой ею силе она существенно превосходит все известные в природе молекулярные моторы. Так, например, максимальная сила, создаваемая при работе одного миозинового мостика актомиозинового комплекса мышечных волокон, составляет fмакс щ 3-5 пН (1 пН = 10-12 Н). Вращательный момент, создаваемый молекулой F₁ за счет гидролиза АТР, достигает величины M щ щљ40 пН Ч нм. Если учесть, что радиус r вращающейся субъединицы составляет r i 1 нм, то сила f, развиваемая молекулой F₁ , будет равна f = М / r i 40 пН. Оказывается, что молекула F₁ приблизительно в 10 раз сильнее актомиозинового комплекса - молекулярной машины, специализирующейся в клетках и различных органах на "профессиональном" выполнении механической работы. Таким образом, за сотни миллионов лет до того, как появился человек, который изобрел колесо, преимущества вращательного характера движения были успешно реализованы Природой на молекулярном уровне.

Протонный канал АТРсинтазы
Вращение ротора АТРсинтазы происходит как при гидролизе АТР, так и в условиях синтеза АТР. Сила, приводящая в движение ротор АТРсинтазы, работающей в режиме синтеза АТР, возникает за счет потока протонов, протекающих через специальный канал. Блокирование протонного канала с помощью ингибитора (дициклокарбодиимид), действующего на одну из субъединицљс мембранного комплекса F₀ , одновременно подавляет вращение ротора и синтез АТР.
Протонный канал АТРсинтазы расположен на границе между субъединицами a и с. Путь переноса протонов включает следующие структурные элементы (рис. 4, А ).
1. Два протонных "полуканала", расположенных в мембранной части АТРсинтазы. Один из них находится ближе к той стороне мембраны, которая обращена в область с повышенной концентрацией ионов водорода (будем называть эту область кислотным резервуаром). Этот полуканал обеспечивает поступление протонов к определенным функциональным группамF₀ , расположенным внутри мотора. Другой полуканал, обращенный в противоположную стороны мембраны, обеспечивает выход протонов в область с пониженной концентрацией ионов водорода (щелочной резервуар). Считается, что полуканалы не связаны друг с другом непосредственно, поскольку они расположены несоосно, то есть смещены друг относительно друга.
2. Кольцо из субъединиц с. Каждая из этих субъединиц в своей центральной части содержит протонируемую карбоксильную группу (R-СООН), которая способна присоединять протон из кислотной области (R-СОО^- + Н⁺ R-СООН) и отдавать его в щелочную область (R-СООН R-СОО^- + Н⁺) через соответствующие протонные каналы.

Рис. 4. Путь переноса протонов через АТРсинтазу. Вверху - цилиндрические структуры символизируют протонные каналы, через которые ионы водорода подводятся к субъединицам с со стороны кислотного резервуара и отводятся от них в сторону щелочного резервуара. Внизу показана схема возможного расположения протонируемых групп на субъединице а (Arg 210) и субъединицах с ротора (Asp 61). Аминокислотный остаток Arg 210 заряжен положительно. Карбоксильная группа аминокислотного остатка Asp 61 может находиться в двух состояниях: протонированном (R-СООН) и депротонированном (R-СОО-). Заряд карбоксильной группы зависит от ее положения относительно верхнего и нижнего протонпроводящих каналов. При контакте этой группы через нижний канал с кислотным резервуаром, где концентрация ионов водорода повышена, карбоксильная группа протонируется (R-СОО- + Н+ R-СООН). Карбоксильная группа, расположенная вблизи от верхнего канала, обращенного в сторону щелочного резервуара, депротонируется - протон диссоциирует и уходит наружу, в результате чего карбоксильная группа становится заряженной отрицательно. За счет взаимодействия заряженных групп субъединиц с и а происходит смещение белковых субъединиц АТРсинтазы друг относительно друга. В результате периодических смещений субъединиц с, обусловленных потоком протонов через протонный канал, происходит поворот субъединицы , погруженной в кольцо из субъединиц с

Главную роль в работе протонного канала АТРсинтазы играют аминокислоты субъединиц a и с, содержащие протонируемые группы. Протонируемые аминокислотные остатки способны удерживать протоны и передавать их друг другу. В АТРсинтазе такими группами являются аминокислотные остатки аспарагиновой кислоты (Asp), аргинина (Arg), гистидина (His) и глютаминовой кислоты (Glu). У E. coli ключевую роль в переносе протонов через АТРсинтазу играет карбоксильная группа аспарагиновой кислоты, расположенной на субъединице с (Aspљ61, цифра 61 обозначает порядковый номер аминокислоты в полипептидной цепи субъединицы с, отсчитываемый с N-конца молекулы белка). Блокирование этой аминокислоты ингибитором (дициклокарбодиимид) или замена Asp 61 на другую аминокислоту путем сайт-специфического (направленного) мутагенеза подавляет ферментативную активность. В то же время мутация, при которой происходит перемещение аспарагиновой кислоты с одной -спирали субъединицы с на другую (каждая субъединица с имеет вид шпильки, состоящей из двух -спиралей, погруженных в мембрану), практически не влияет на работу протонного канала. Второй важной аминокислотой, связанной с переносом протонов, является аргинин (Arg 210), входящий в состав субъединицы a (рис. 4, Б ). В переносе протонов через АТРсинтазу, по-видимому, участвуют и другие аминокислотные остатки субъединицы а, однако их роль в создании вращательного момента, приводящего ротор во вращение, не столь существенна, как Asp 61 и Arg 210.
Схема возможного расположения функциональных групп на белковых субъединицах F₀ и последовательность процессов, в результате которых перенос протонов через F₀ показаны на рис. 4. Некоторые исследователи считают, что перенос протона от нижнего полуканала в верхнему связан с вращением всего кольца, образованного субъединицами c (на рис. 4 этому соответствует вращение кольца против часовой стрелки). Данная гипотеза, однако, еще не получена экспериментального подтверждения.
Движение протонов через АТРсинтазу может происходить не только за счет разности концентраций ионов водорода по обе стороны мембраны, но также под действием разности электрических потенциалов. Если электрический потенциал со стороны комплекса F₁ ниже, чем с противоположной стороны, то под действием электрического поля, направленного поперек мембраны в сторону F₁ , возникнет поток протонов через АТРсинтазу. Положительный потенциал со стороны нижнего полуканала будет способствовать протонированию, а отрицательный потенциал со стороны верхнего полуканала - депротонированию карбоксильных групп субъединиц c. Поддерживая на мембране достаточно высокую разность электрических потенциалов () можно заставить мотор вращаться даже при одинаковых концентрациях ионов водорода по обе стороны мембраны. Как правило, для этого достаточно создать на мембране разность потенциалов ~ 180-200 мВ. Интересно, что существуют бактерии, у которых АТРсинтазы используют энергию не протонного, а натриевого потенциала [1, 2].
Объем работы, которую производят АТРсинтазы, поражает грандиозными масштабами. Как заметил П.љБойер, общая масса молекул АТР, синтезируемых в организме взрослого человека в течение суток, сопоставима с массой самого человека. В этом нет ничего странного. В организме идут многочисленные биохимические процессы, в ходе которых АТР интенсивно расходуется. Поэтому, чтобы организм мог жить, его АТРсинтазы вынуждены крутиться, своевременно восполняя запасы молекул АТР.

ВРАЩАЮЩИЕСЯ ЭЛЕКТРОМОТОРЫ БАКТЕРИЙ
Для того чтобы плавать, бактерии с помощью специальных электромоторов вращают свои жгутики [2]. Так, например, с поверхности бактерии E. coli    наружу выступают приблизительно шесть жгутиков, каждый из которых представляет собой спиралевидную нить диаметром 15 нм и длиной 10 мкм. Когда жгутики начинают синхронно вращаться против часовой стрелки, они сплетаются в единый пучок, который образует своеобразный пропеллер (рис 5, А ). Вращение пропеллера создает силу, заставляющую бактерию двигаться почти по прямой линии. После того как направление вращения жгутиков изменяется на противоположное, пучок расплетается и бактерия останавливается, вместо постурательного движения она начинает хаотически вращаться, ее ориентация изменяется. В тот момент, когда все жгутики бактерии снова начнут синхронно вращаться против часовой стрелки, образовав пропеллер, толкающий бактерию, направление ее поступательного движения будет отличаться от первоначального. Таким способом бактерия может изменять направление своего движения. Как и протонные АТРсинтазы, электромоторы бактерий являются устройствами, которые в качестве источника энергии используют разность протонных потенциалов на цитоплазматической мембране. Принципы работы АТРсинтазы и бактериального мотора одинаковы, хотя сами эти конструкции различаются по своим размерам и устройству. Схематическое изображение бактериального мотора показано на рис. 5. Мотор состоит из ротора, статора и некоторых вспомогательных белковых субъединиц, выполняющих роль подшипника, внутри которого вращается стержень ротора (об устройстве и механизмах работы бактериального электромотора см. подробнее [2]). Важными узлами бактериального электромотора являются два соосных диска (называемые М- и S- дисками), центры которых соединены с вращающимся стержнем, выступающим наружу. На периферии диска М находятся многочисленные копии белка, названного МotB. Несколько копий белка МotА, входящего в состав статора, встроены в мембрану и примыкают к краям дисков М и S. Механизм генерации силы, приводящей ротор

во вращение, по-видимому, имеет ту же природу, что и в случае АТРсинтазы. Вращающий момент возникает за счет взаимодействия субъединиц Мot B с белковыми субъединицами Мot А, расположенными на статоре электромотора. Считается, что в состав субъединицы Мot А входят два несоосных протонных полуканала. Подобно протонному каналу АТРсинтазы, путь переноса протонов через мембрану проходит через протонные полуканалы субъединиц Мot А и Мot В [2]. В результате переноса протонов через белки Мot А и Мot В, направленного внутрь бактериальной клетки, происходит вращение ротора. Один полный оборот ротора связан с переносом через мембрану около 1000 протонов.

Рис. 5. А - схематическое изображение электромотора, вращающего жгутики бактерий. Центры двух соосных дисков (М и S) соединены с вращающимся стержнем, выступающим наружу. На периферии диска М находятся моторные белки Мot B. Белки Мot А встроены в мембрану и примыкают к краям дисков М и S; Б - схема возможного расположения субъединиц MotљA и MotљB, образующих каналы, через которые протоны из периплазматического пространства переносятся в цитоплазму бактериальной клетки (модификация рисунка из книги: Stryer L., Biochemistry. N.Y.: Freeman and Kњ). Вращающий момент, вызывающий поворот ротора мотора, возникает за счет взаимодействия субъединиц Мot B с белковыми субъединицами Мot А, расположенными на статоре электромотора

Электромоторы бактерий работают очень эффективно. Бактерии плавают со средней скоростью около 25 мкм/с, но некоторые виды могут двигаться поступательно со скоростью больше 100 мкм/с. Это означает, что за одну секунду бактерия перемещается на расстояние, которое в десять или большее число раз превышает ее собственную длину. Любопытно провести аналогию с движением систем макроскопических размеров. Например, если бы пловцы преодолевали за одну секунду расстояние, на порядок превышающее их собственный рост, то стометровую дорожку плавательного бассейна они бы проплывали приблизительно за 5 с. Обычно электромотор бактерий вращается со скоростью, достигающей 50-100 оборотов в секунду, однако у некоторых видов бактерий скорость вращения превышает 1000 оборотов в секунду. Электромоторы, которые могут так быстро вращать жгутики бактерий, очень экономичны - они потребляют не более 1% энергетических ресурсов бактериальной клетки.
Рассмотренными примерами не ограничивается все разнообразие вращающихся моторов, которые встречаются в природе. Существуют бактерии, у которых АТРсинтазы используют энергию не протонного, а натриевого потенциала [1, 2]. Изучение молекулярных моторов продолжается; несомненно, что дальнейшие исследования помогут детальнее выяснить механизмы их работы.

ЛИТЕРАТУРА
1. Скулачев В.П. Законы биоэнергетики // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. N 1. С. 9-14.
2. Скулачев В.П. Электродвигатель бактерий // Там же. 1998. N 9. С. 2-7.
3. Тихонов А.Н. Трансформация энергии в хлоропластах - энергопреобразующих органеллах растительной клетки // Там же. 1996. N 4. С. 24-32.
4. Тихонов А.Н. Молекулярные преобразователи энергии в живой клетке // Там же. 1997. N 7. С. 10-17.
5. Noji H., Yasuda R., Yoshida M., Kinoshita K., Jr. Direct Observation of the Rotation of F₁-ATPase // Nature. 1997. Vol. 386. P. 299-302.
6. Kinoshita K., Jr., Yasuda R., Noji H., Ishiwata S., Yoshida M. F₁-ATPase: A Rotary Motor Made of a Single Molecule // Cell. 1998. Vol. 93. P. 21-24.
* * *
Александр Николаевич Тихонов, доктор физико-математических наук, профессор, главный научный сотрудник кафедры биофизики физического факультета МГУ. Область научных интересов - биофизика фотосинтеза, биоэнергетика, магнитная радиоспектроскопия. Автор трех книг и более 140 статей в отечественных и зарубежных научных журналах.