Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   BOAI: наука должна быть открытой Обратите внимание!
 
  Наука >> Биология >> Молекулярная биология | Обзорные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение
 См. также

Обзорные статьиА.С. Спирин. Биосинтез белка: элонгация полипептида и терминация трансляции

Обзорные статьиА.С. Спирин. Биосинтез белка: инициация трансляции

Обзорные статьиА.С. Спирин. Принципы структуры рибосом

Обзорные статьиА.С. Спирин. Биосинтез белка: элонгация полипептида и терминация трансляции: (1)

Научные статьиБиогенез: мотивы и феномены возникновения жизни

В начало...

Принципы функционирования рибосом. А. С. СПИРИН. Продолжение.

ПРИНЦИП N 2: КОНФОРМАЦИОННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ РИБОСОМЫ
Работа рибосомы в качестве "лентопротяжного механизма" последовательное прочитывание цепи мРНК от одного конца к другому) в ходе элонгации (см. рис. 1) и ее способность перебрасывать сравнительно большие молекулярные массы (молекулы тРНК) из одного участка в другой в каждом элементарном элонгационном цикле (см. рис. 2, шаг 3 ) предполагают ее механическую подвижность. Взаимная подвижность двух рибосомных субчастиц может быть основным видом крупноблочной подвижности рибосомы в ходе работы, и имеются экспериментальные свидетельства в пользу такой подвижности. Кроме того, существуют указания на подвижность "головки" малой рибосомной субчастицы относительно ее "тела" и на подвижность палочкообразного бокового выступа большой рибосомной субчастицы.

Рис. 2. Элементарный элонгационный цикл рибосомы, в результате которого прочитывается один триплет (кодон) мРНК и образуется одна пептидная связь (добавляется одна аминокислота к растущему полипептиду).
В каждый данный момент в ходе элонгации рибосома сидит на участке кодирующей последовательности мРНК и удерживает молекулу пептидил-тРНК. Пептидил-тРНК есть растущая полипептидная цепь, ковалентно присоединенная своим С-концом к тРНК, которая и принесла последний (С-концевой) аминокислотный остаток растущему пептиду. Когда пептидил-тРНК занимает Р-участок рибосомы (состояние I ), рибосома может связывать молекулу аминоацил-тРНК, соответствующую кодону, установленному на данный момент в А-участке (шаг 1 ). В результате удерживаемая рибосомой пептидил-тРНК и вновь связанная аминоацил-тРНК оказываются в рибосоме бок о бок (состояние II ). Рибосома (ее пептидилтрансферазный центр на большой субчастице) катализирует реакцию транспептидации между этими двумя субстратами рибосомы - пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК: пептидильный остаток переносится от "своей" тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, тем самым удлиняясь на одну аминокислоту на С-конце (шаг 2 ). Теперь в Р-участке осталась деацилированная тРНК, а в А-участке помещается остаток тРНК удлиненной пептидил-тРНК (состояние III ). Следующий за этим акт транслокации состоит в том, что деацилированная тРНК выталкивается из Р-участка, а пептидил-тРНК (ее остаток тРНК) перемещается вместе со связанным с ней кодоном мРНК из А-участка в Р-участок (шаг 3 ). В итоге А-участок освобождается, и в нем устанавливается следующий кодон мРНК. Цикл завершился. Повторение таких циклов по числу кодонов мРНК создает полный процесс элонгации. Следует отметить, что шаг 1 (связывание аминоацил-тРНК) катализируется белком - фактором элонгации EF1 - с участием ГТФ, а шаг 3 (транслокация) - другим белком - фактором элонгации EF2 - и тоже с участием ГТФ. В ходе катализа ГТФ расщепляется (гидролизуется) до ГДФ и ортофосфата


На рис. 2 схематически изображены три функциональных состояния транслирующей рибосомы с фиксированными положениями лигандов (тРНК) в А- и Р-участках и переходы между состояниями. Однако со структурно-молекулярной точки зрения переходы между состоянием I и состоянием II (кодонзависимое связывание аминоацил-тРНК) и особенно между состоянием III и состоянием I (транслокация) кажутся затруднительными без промежуточных состояний, где рибосомные лиганды имели бы некоторую свободу внутририбосомных перемещений или были бы частично делокализованы. Необходимость промежуточных состояний вытекает из простого соображения: такие большие (с молекулярной точки зрения) лиганды, как тРНК, должны связываться с рибосомой несколькими контактными точками своей поверхности (многоцентровое связывание), а одновременное образование или разрыв многих контактов должны сопровождаться большими кинетическими (энергетическими) барьерами, делающими такие процессы крайне медленными (маловероятными).
Конформационная подвижность рибосомы, и в первую очередь взаимная подвижность рибосомных субчастиц, позволяет разрешить эту проблему. На рис. 5 представлена модель, согласно которой рибосома при прохождении элонгационного цикла осциллирует между двумя конформационными состояниями: закрытым (сомкнутым) и открытым (разомкнутым). В сомкнутом состоянии рибосомные лиганды (тРНК) зажаты между субчастицами, связаны максимальным количеством контактов с рибосомой и не имеют внутририбосомной подвижности. В разомкнутом состоянии рибосомы лиганды более подвижны, контакты с рибосомой менее полны, и имеется возможность их входа и выхода из рибосомы. Так, на первом этапе связывания аминоацил-тРНК рибосома должна быть открыта для приема лиганда. Возможно, это открытое состояние фиксируется фактором элонгации EF1. Далее EF1 уходит, рибосомные субчастицы плотно смыкаются, и аминоацильный конец связавшейся аминоацил-тРНК вступает в контакт с пептидилтрансферазным центром большой субчастицы. В сомкнутом состоянии пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК тесно сближены, и между ними происходит реакция транспептидации. Теперь, чтобы выбросить деацилированную тРНК из рибосомы и дать свободу для перемещения остатка тРНК молекулы пептидил-тРНК из А-участка в Р-участок, рибосому надо приоткрыть, в частности путем раздвигания субчастиц. Это может осуществляться фактором элонгации EF2. После ухода EF2 с рибосомы она снова смыкается и ждет прихода очередной аминоацил-тРНК с фактором элонгации EF1.

Рис. 5. Модель динамической работы рибосомы в элонгационном цикле (на данной схеме "головки" обеих рибосомных субчастиц обращены к зрителю). Модель постулирует, что две рибосомные субчастицы подвижно соединены друг с другом и способны к некоторому раздвиганию (размыканию) и сдвиганию (смыканию). Размыкание открывает функциональные центры на контактирующих поверхностях субчастиц, такие, как А-участок для приема аминоацил-тРНК, и способствует перемещению лигандов, например в ходе транслокации. Смыкание субчастиц запирает лиганды внутри рибосомы и приводит в тесный контакт субстраты для реакции транспептидации. Предполагается, что размыкание индуцируется факторами элонгации с ГТФ, а гидролиз ГТФ и уход факторов с рибосомы позволяют ей снова сомкнуться.
На рисунке представлено рассмотрение элонгационного цикла с точки зрения модели смыкания-размыкания: 1љ- связывание аминоацил-тРНК с рибосомой требует размыкания, и фактор элонгации EF1 с ГТФ призван "открыть" рибосому; 2 - после расщепления ГТФ фактор элонгации EF1 покидает рибосому, а аминоацильный конец аминоацил-тРНК взаимодействует с пептидилтрансферазным центром большой субчастицы и тем самым способствует смыканию субчастиц и запиранию рибосомы; 3 - реакция транспептидации происходит в "закрытой" рибосоме между тесно сближенными группами двух субстратов - пептидил-тРНК и аминоацил-тРНК; 4 - размыкание претранслокационной рибосомы промотируется фактором элонгации EF2 с ГТФ, что приводит к выходу деацилированной тРНК и смещению остатка тРНК молекулы пептидил-тРНК вместе с мРНК; 5 - гидролиз ГТФ и как следствие уход фактора элонгации EF2 снова дает возможность рибосоме сомкнуться. Таким образом, транслирующая рибосома в ходе элонгационного цикла осциллирует между сомкнутым и разомкнутым состояниями

Следует подчеркнуть, что процесс периодического смыкания-размыкания рибосомы является энергозависимым: факторы элонгации EF1 и EF2 взаимодействуют с рибосомой только будучи связанными с ГТФ (согласно модели, при этом взаимодействии происходит открывание рибосомы), а взаимодействие с рибосомой наводит ГТФазную активность, ГТФ гидролизуется, фактор элогации теряет сродство к рибосоме и уходит, и рибосома закрывается. Таким образом, на каждое смыкание-размыкание рибосомы расходуется одна молекула ГТФ. Так как в каждом элонгационном цикле рибосома смыкается-размыкается дважды, то две молекулы ГТФ расходуются на каждый цикл. Это есть энергетическая плата за эффективное (быстрое и надежное) функционирование рибосомы как молекулярной машины.

ПРИНЦИП N 3: ГТФ-ЗАВИСИМЫЙ КАТАЛИЗ КОНФОРМАЦИОННЫХ ПЕРЕХОДОВ
Вместе с тем оказывается, что термодинамически все три шага элонгационного цикла - связывание аминоацил-тРНК, транспептидация и транслокация - это спонтанные процессы, сами по себе идущие с понижением свободной энергии. Действительно, аминоацил-тРНК может специфически, кодонзависимым образом связываться с рибосомой и образовывать нормальный функциональный комплекс (состояние II на рис. 2) при отсутствии фактора элонгации EF1 и ГТФ, хотя и значительно медленнее, чем в их присутствии (так называемое неэнзиматическое связывание аминоацил-тРНК). Транспептидация, как известно, всегда катализируется лишь самой рибосомой и является типичной экзергонической (идущей с большим понижением свободной энергии) реакцией. Претранслокационное состояние рибосомы (состояние III на рис. 2) термодинамически нестабильно и может медленно скатываться в посттранслокационное состояние спонтанно, без фактора элонгации EF2 и ГТФ (так называемая неэнзиматическая транслокация). В целом, когда в условиях in vitro (в бесклеточных системах) рибосомы снабжены лишь матричным полинуклеотидом и аминоацил-тРНК, возможна медленная неэнзиматическая, или бесфакторная, трансляция без каких-либо дополнительных источников энергии в виде ГТФ или АТФ.
Дело в том, что основным источником свободной энергии для производства полезной работы (синтез полипептида со строго заданной аминокислотной последовательностью) в процессе элонгации является реакция транспептидации (рис. 3). В этой реакции сложноэфирная связь молекулы пептидил-тРНК заменяется на пептидную связь в удлиненной пептидил-тРНК. Свободная энергия гидролиза сложноэфирной связи между аминокислотным остатком и рибозой тРНК оценивается величиной от - 7 до - 8 ккал/моль, а свободная энергия гидролиза пептидной связи около - 0,5 ккал/моль. Следовательно, чистый выигрыш свободной энергии в реакции транспептидации составляет около - 7 ккал/моль, то есть сравним со свободной энергией гидролиза АТФ или ГТФ. Другими словами, транспептидация - экзергоническая реакция, способная "накормить" энергией работающую рибосому и обеспечить спонтанное прохождение элонгационного цикла.
Для чего же тогда потребляется ГТФ, да еще и по две молекулы на элонгационный цикл? Очевидно, не на производство полезной работы (в термодинамическом смысле слова). Показано, что гидролиз ГТФ в элонгационном цикле при участии рибосомы и факторов элонгации химически не сопряжен ни с какой другой ковалентной реакцией и не связан с образованием какого бы то ни было фосфорилированного интермедиата. Это прямая атака молекулы воды на пирофосфатную связь ГТФ, и освобождаемая свободная энергия гидролиза полностью диссипирует в тепло. Вместе с тем участие факторов элонгации и катализируемый ими гидролиз ГТФ очень сильно (на несколько порядков) увеличивает скорость элонгации. Это позволяет думать, что главная роль гидролиза ГТФ в элонгационном цикле чисто каталитическая, то есть кинетическая, а не термодинамическая.
Данное обстоятельство весьма необычно с энзиматической точки зрения. Ведь обычно подразумевается, что катализ, в том числе энзиматический катализ, ускоряет спонтанные реакции без какого-либо потребления дополнительной энергии - свободная энергия освобождается в результате самой катализируемой реакции. Однако вся теория энзиматического катализа разработана для ковалентных реакций. Ее суть состоит в том, что фермент имеет сродство к переходному состоянию катализируемой реакции. Тем самым за счет энергии сродства именно к переходному состоянию исходный субстрат изменяется и фиксируется белком-ферментом в этом состоянии. Энергетический барьер взят. Но образовавшийся комплекс фермента с переходным интермедиатом был бы тупиковым (непродуктивным), если бы интермедиат спонтанно не разваливался на продукты реакции с освобождением свободной энергии, компенсирующей энергию взаимодействия с ферментом. Таким образом, экзергоничность катализируемой реакции необходима для десорбции продукта с фермента.
В случае катализа конформационных превращений, каковой наблюдается в элонгационном цикле при EF1-промотируемом связывании аминоацил-тРНК и EF2-промотируемой транслокации (рис. 2 и 5), ситуация иная. Здесь, очевидно, белок-катализатор (EF1 или EF2) тоже имеет сродство к переходному конформационному состоянию рибосомы и тем самым за счет этой энергии взаимодействия фиксирует его. Далее рибосоме надо выйти из этого комплекса, чтобы "упасть" в следующее (продуктивное) состояние. Это было бы невозможно - комплекс оказался бы ловушкой, тупиком, - если бы не участие ГТФ. Природа устроила так, что фактор элонгации может взаимодействовать с рибосомой только после ассоциации с ГТФ: молекула ГТФ за счет сродства к фактору изменяет его конформацию так, что он приобретает сродство к рибосоме. Следовательно, именно фактор элонгации с лигандом ГТФ фиксирует переходное конформационное состояние рибосомы. Но посадка фактора на рибосому индуцирует ГТФазную активность фактора, ГТФ гидролизуется, и как следствие фактор теряет сродство к рибосоме и уходит. Рибосома "падает с барьера" в термодинамически устойчивое состояние. Другими словами, энергия сродства фактора элонгации к переходному конформационному состоянию компенсируется сопутствующей ковалентной реакцией, идущей с понижением свободной энергии.
Таким образом, прямой гидролиз ГТФ представляется необходимым для "энзиматического" (фактор-промотируемого) катализа нековалентных конформационных переходов в элонгационном цикле. Основная роль этого гидролиза - разрушение лиганда, обеспечивающего сродство катализатора к переходному конформационному состоянию, чтобы дать возможность выйти из этого промежуточного комплекса и перейти к следующему - продуктивному - состоянию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Принципы структурной организации рибосомы, сформулированные в предыдущей статье [1], и в еще большей степени принципы функционирования, описанные здесь, отражают лишь сегодняшний уровень наших знаний и, естественно, не могут претендовать на полноту и достаточность для цельного понимания взаимосвязи между структурой и функцией. Тем не менее это первая попытка увязать структуру с функцией и представить не просто перечисление и описание различных структурных особенностей этой частицы и ее многочисленных функциональных проявлений, а обобщенную концептуальную картину. Кое-что здесь гипотетично. Многое потребует дополнения в ближайшем будущем, а что-то и исправления. Но мне кажется, что как с научной, так и с образовательной точки зрения формулирование принципов, пусть неполное и предварительное, важнее и интереснее, чем просто систематизация фактов. Хочу заметить, что изложенные обобщения и идеи являются результатом моей работы в области исследования рибосом и регулярного обдумывания этих результатов на протяжении последних 35 лет.

ЛИТЕРАТУРА
1. Спирин А.С. Принципы структуры рибосом // Соросовский Образовательный Журнал. 1998. N 11. С. 65-70.
2. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш. шк., 1986. 300 с.
3. Спирин А.С. О механизме работы рибосомы: Гипотеза смыкания-размыкания субчастиц // Докл. АН СССР. 1968. Т. 179. С. 1467-1470.
4. Spirin A.S. Energetics and Dynamics of the Protein-synthesizing Machinery // The Roots of Modern Biochemistry. B.; N.Y.: Walter de Gruyter and Co., 1988. P. 511-533.
* * *
Александр Сергеевич Спирин, доктор биологических наук, профессор и зав. кафедрой молекулярной биологии МГУ, директор Института белка РАН, действительный член РАН и член Президиума РАН, действительный член РАЕН, Российской академии биотехнологии и многих международных и зарубежных академий и организаций. Основной круг научных исследований - структура и функция белоксинтезирующего аппарата, регуляция биосинтеза белков, бесклеточные системы биосинтеза белков, котрансляционное сворачивание белков. Автор одного из томов ("Структура рибосомы и биосинтез белка") трехтомного учебника для вузов "Молекулярная биология", монографии "Рибосома" (два издания) на русском языке и трех монографий, изданных в США и Германии на английском языке, переведенных также на другие языки. Автор около 300 публикаций в российских и международных журналах.


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования