Rambler's Top100 Service
Поиск   
 
Обратите внимание!   Обратите внимание!
 
  Наука >> Биология >> Генетика | Обзорные статьи
 Написать комментарий  Добавить новое сообщение

Конверсия гена
В. М. ГЛАЗЕР
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

ВВЕДЕНИЕ
Конверсия гена, которой посвящена эта статья, является биологическим процессом, играющим важную роль и в эволюции живых организмов, и в их онтогенезе. Помимо того что конверсия гена участвует в общей (гомологичной) рекомбинации [1], она является одним из проявлений другого фундаментального генетического процесса - репарации ДНК [2]. Хотя в основе конверсии лежит общий механизм - исправление (коррекция) неспаренных (некомплементарных) оснований в рекомбинационном гетеродуплексе ДНК [1], этот механизм может участвовать в разнообразных биологических процессах, часто играя ключевую роль. Конверсия происходит и в клетках бактерий, и в половых и в соматических клетках эукариот.
Первоначально, со времени ее открытия К. Линдегреном в 1949 году [3], термин "конверсия гена" применяли только к конкретному явлению - нарушению стандартного менделевского расщепления 2А : 2а в тетрадах аскоспор у грибов-аскомицетов [1, 3]. Однако, после того как был выяснен универсальный механизм коррекции неспаренных оснований, этот термин распространили на все процессы, в которых происходит превращение одного аллеля в другой путем коррекции рекомбинационного гетеродуплекса. Читатель, прочитавший эти строки, должен был заметить, что эта статья является логическим продолжением статей [1, 2], ранее опубликованных в "Соросовском Образовательном Журнале".

ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОЦЕССАХ, ПРИВОДЯЩИХ К КОНВЕРСИИ ГЕНА, НА ПРИМЕРЕ ESCHERICHIA COLI
Биологические аспекты конверсии сложны и многообразны. Для облегчения их восприятия сначала рассмотрим молекулярные процессы, лежащие в основе конверсии. Начнем с того, что у всех видов живых организмов среди различных систем репарации важнейшее место занимает особый механизм исправления ошибок репликации ДНК. Репарируемые ошибки заключаются в том, что иногда (редко!) в ходе репликации ДНК-полимераза ошибочно включает во вновь синтезируемую цепь ДНК основание, некомплементарное основанию в матричной цепи. Механизм репарации некомплементарных оснований наиболее изучен у E. coli под названием "система MutHSLU". Хотя он подробно описан в статье [2], напомним основные детали. Основу системы составляют гены mutH, mutL, mutS и mutU. Название mut (mutator) указывает на то, что мутанты по этим генам проявляют мутаторный фенотип, то есть у них наблюдается резкое повышение (обычно на несколько порядков) частоты спонтанного мутирования. Этот факт служит прямым доказательством того, что неспаренные основания являются предшественниками мутаций. Кроме того, он свидетельствует, что продукты указанных генов участвуют в устранении неспаренности оснований.
Система MutHLSU узнает и исправляет все пары некомплементарных оснований (G/T, G/A, T/C и т.д.), кроме пары С/C. Она репарирует еще выпадения или вставки одного-трех нуклеотидов в одной из цепей ДНК. В случае исправления ошибок репликации ДНК процесс связан с метилированием аденина в последовательностях GATC. Рассматриваемый механизм основан на том, что матричные цепи ДНК исходно метилированы, тогда как метилирование вновь синтезируемых цепей чуть-чуть запаздывает за репликацией, оставляя небольшое окно во времени для работы коррекционной системы. Процесс (см. рис. 1 в статье [2]) начинается с присоединения к некомплементарной паре оснований белка MutS, роль которого заключается в узнавании этого типа нарушений структуры ДНК. С образовавшимся комплексом связывается белок MutL. Взаимодействие MutS и MutL с некомплементарной парой оснований активирует латентную эндонуклеазу - продукт гена mutH, которая расщепляет одну из цепей ДНК в сайте GATC в дочерней неметилированной цепи. Возникший разрыв служит сигналом для коррекции этой цепи. От конца разрыва экзонуклеаза гидролизует цепь ДНК в направлении ошибочного основания и удаляет его. Экзонуклеазы, осуществляющие вырезание (эксцизию) участка цепи ДНК, гидролизуют одноцепочечную ДНК. Для их работы необходимо участие ДНК-хеликазы (белка MutU), которая обеспечивает высвобождение одноцепочечной ДНК путем расплетания дуплекса. Образуется брешь протяженностью до 1 т.п.н. и более. Она застраивается по матрице исходной метилированной цепи с помощью ДНК-полимеразы, а затем ДНК-лигаза залечивает оставшийся разрыв цепи. Ошибка репликации исправлена. Рассмотренный механизм коррекции, когда репарации подвергается определенная цепь ДНК, называется направленным, хотя в других случаях выбор цепи, подвергаемой коррекции, может быть случайным. Он также относится к системам репарации с вырезанием и застройкой протяженных брешей.
Подчеркнем, что процесс исправления ошибок репликации гена не относится к конверсии гена. Мы вспомнили о нем только потому, что его механизм используется и в коррекции рекомбинационного гетеродуплекса, а это уже конверсия. Таким образом, коррекция неспаренных оснований есть широкое понятие, включающее и исправление ошибок репликации, и конверсию гена.
Для изучения механизмов конверсии у бактерий (как и у эукариот) создают искусственные гетеродуплексы, содержащие различные комбинации некомплементарных оснований, вводят их в реципиентные клетки и прослеживают дальнейшую судьбу. Используя в качестве реципиентов клетки, несущие различные мутации по репарации и рекомбинации, выявляют (по неспособности к коррекции) гены, контролирующие исправление того или иного типа некомплементарных пар, и выясняют основные характеристики конверсии. Например, Р. Фишель и др. (1988 год) вводили в клетки различных мутантов E. coli искусственные гетеродуплексы, которые содержали две группы неспаренных оснований, разделенные 1243 п.н. Кроме того, в их эксперименте цепи ДНК в гетеродуплексах были либо метилированы по аденину, либо неметилированы. Оказалось, что независимо от метилированности цепей репарация происходила до репликации ДНК и при этом в большинстве случаев наблюдалась одновременная коррекция (кокоррекция) обеих неспаренных групп, то есть механизм репарации протяженных брешей был доминирующим. Если была метилирована одна из цепей, кокоррекции подвергалась неметилированная цепь. Процесс контролировали все четыре гена системы MutHLSU. Если обе цепи были неметилированы, процесс также требовал продуктов всех четырех генов, но если обе цепи были метилированы - только генов mutS и mutU. Но и в том и в другом случае выбор цепи, подвергшейся кокоррекции, был случаен.
Помимо MutHSLU у E. coli описаны и другие системы коррекции рекомбинационного гетеродуплекса. Обычно они узнают более узкий спектр неспаренных оснований, некоторые из них специфичны для определенных некомплементарных пар. Например, система VSP (very short patch repair) превращает некомплементарную пару GЧT в комплементарную G-C. Как следует из названия, эта система вырезает и застраивает очень короткие (не более пяти нуклеотидов) участки цепи ДНК, содержащие неспаренный тимин. Наряду с другими генами в ней также участвуют гены mutL и mutS. Можно привести также систему с участием генов recF, recJ и recO. Она работает на участке не более 300 п.н. и малоэффективна по сравнению с MutHSLU. Еще следует отметить, что другие виды бактерий имеют системы репарации ошибок репликации и коррекции гетеродуплексов, родственные MutHSLU, но не связанные с метилированием ДНК. В тех случаях, когда коррекция осуществляется направленно, выбор подвергаемой эксцизии цепи определяется наличием в этом районе одноцепочечного разрыва. Это правило распространяется и на эукариотические организмы.
Мы уделили так много внимания системе MutHSLU, так как два ее основных компонента - белки MutL и MutS - оказались консервативными и в ходе эволюции сохранились не только у бактерий, но и у эукариот, от дрожжей до человека. В следующем разделе рассмотрим именно эти эукариотические белки, запускающие процесс конверсии, не забывая при этом об участии ДНК-полимераз, лигаз, хеликаз и других белков общего метаболизма ДНК.

ГОМОЛОГИ БЕЛКОВ MutL и MutS У ЭУКАРИОТ
Эукариотические гомологи бактериальных белков MutL называют MLH (MutL homolog) или PMS (post meiotic segregation), а гомологи MutS - MSH (MutS homolog). Их удалось выявить по гомологии с бактериальными белками и с помощью биохимического анализа с использованием клеточных экстрактов. Как и у бактерий, эти белки могут участвовать и в исправлении ошибок репликации, и в конверсии. Главное доказательство участия каждого белка в конверсии - повышение частоты так называемой постмейотической сегрегации (ПМС) у мутанта по соответствующему гену. ПМС возникает как результат подавления конверсии и проявляется в виде секторных колоний, выросших из клеток, содержащих нерепарированный гетеродуплекс: каждая половина колонии несет один из аллелей, имеющихся в гетеродуплексе.
Эукариотические белки взаимодействуют с неспаренными основаниями по той же схеме, что и их бактериальные гомологи. Однако в отличие от бактерий эукариотические гомологи проявляют большое разнообразие и представлены семействами. У дрожжей обнаружены три гомолога MutL (MLH1, MLH2, PMS1) и шесть гомологов MutS (от MSH1 до MSH6), у человека - соответственно 11 и 4. Это свидетельствует о большей сложности и разнообразии систем коррекции у эукариот. Правда, не все белки заняты в конверсии. Так, дрожжевые белки MSH4 и MSH5 участвуют в мейотическом реципрокном кроссинговере, но не в конверсии. Белок MSH1 обеспечивает стабильность ДНК в митохондриях.
Функции некоторых белков еще не выяснены. Из гомологов MutL по крайней мере два - MLH1и PMS1 (у человека PMS2) участвуют в исправлении ошибок репликации и в конверсии. У мутантов по генам, кодирующим эти белки, резко повышены частоты спонтанных мутаций и ПМС. В норме оба белка работают в комплексе, который эквивалентен одному бактериальному белку MutL. Из гомологов MutS по крайней мере три (MSH2, MSH3 и MSH6) функционируют в тех же процессах. MSH2 формирует два разных гетеродимера, один с MSH3, другой с MSH6. Первый участвует только в коррекции вставок / выпадений нуклеотидов, второй - и вставок / выпадений, и некомплементарных пар оснований. Эукариотическая система отличается от бактериальной и более широким спектром распознаваемых нарушений структуры дуплекса. Она узнает и репарирует гетерологии из 8-12 нуклеотидов (бактериальная не более трех). Кроме того, в клетках млекопитающих эта система узнает даже пары СЧС. Отметим, что система участвует и в мейотической и в митотической конверсии. Недавно в лаборатории В.Г. Королева (Петербург) был обнаружен седьмой гомолог MutS у дрожжей - продукт гена HSM3. Оказалось, что новый белок участвует в каком-то ином пути коррекции гетеродуплеса, нежели система с участием PMS1.

ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О КОНВЕРСИИ ГЕНА
В настоящее время общепризнаны две модели рекомбинации, приводящие к конверсии. Одна из них - модель Р. Холлидея, вторая - Дж. Жостака и др., в которой рекомбинация начинается с двуцепочечного разрыва в одном из гомологов. Обе модели рассмотрены в статье [1]. Для краткости изложения ограничимся демонстрацией конверсии на примере модели Холлидея (рис. 1). Поскольку читатель уже знаком с моделью, в рисунок включены только те ее этапы, которые непосредственно относятся к конверсии. Как видно из рис. 1, если в тетраде произошел кроссинговер в участке гена В, то соотношение аллелей генов А и С, внешних (фланговых) по отношению к участку кроссинговера, не изменяется и остается равным 2А : 2а и 2С : 2с (рис. 1, г), то есть рекомбинация по ним реципрокна. Напротив, рекомбинация маркеров, попавших непосредственно в участок кроссинговера, то есть в гетеродуплекс, обычно нереципрокна из-за коррекции неспаренных оснований, внесенных разными аллелями (B и b). Протяженность гетеродуплекса в мейотической рекомбинации достигает 1 т.п.н., в случае митотической рекомбинации она еще больше. Все гетерозиготные маркеры, попавшие в гетеродуплекс, обычно конвертируют совместно, что является следствием существования участка конверсии [3]. Этот факт основан на работе рассмотренной выше системы коррекции с вырезанием и застройкой длинных брешей.

Рис. 1. Упрощенная схема конверсии гена по модели Холлидея. Линии соответствуют цепям ДНК, две параллельные линии - хроматиде. Синий и красный цвета позволяют различать гомологов. Вертикальные линии слева обозначают центромеры, удерживающие сестринские хроматиды. Пара синих и пара красных сестринских хроматид образует тетраду. Более детально модель Холлидея представлена в [1]; а - полухиазма Холлидея, сформированная в результате обмена цепями между двумя хроматидами с последующей миграцией ветвления; б - два типа продуктов рекомбинации, возникшие в результате двух способов разрешения полухиазмы. Слева структуры с гетеродуплексом, но без кроссинговера по внешним маркерам. Справа структуры с гетеродуплексом и кроссинговером по внешним маркерам; в - в левой тетраде происходит конверсия от В к b, в правой - от b к В. Направление конверсии в тетрадах выбрано произвольно. Также произвольно выбрана и стадия, на которой происходит конверсия. Она может осуществляться и раньше, до разрешения полухиазмы; г - продукты рекомбинации


А теперь выделим другие основные закономерности процесса конверсии. Конверсия обычно равнонаправленна. Выбор удаляемого основания из двух неспаренных случаен, поэтому тетрады 3B : 1b и 1B : 3b равновероятны. Конверсия полярна. Это проявляется в том, что частоты конверсии разных аллелей одного гена закономерно снижаются, начиная с определенной точки, чаще всего от одного конца гена к другому. У дрожжей они обычно варьируют от 18% до долей процента. Так как частота конверсии аллеля зависит от вероятности его попадания в гетеродуплекс, то полярность указывает на наличие в хромосомах фиксированных сайтов, в которых инициируется рекомбинация. В последние годы у дрожжей идентифицировано несколько таких сайтов. Их называют горячими точками рекомбинации. Например, по данным Дж. Жостака и др., частота конверсии в начале гена ARG4 составляет около 7,4%, затем она постепенно снижается. Удаление участка из 875 п.н. непосредственно перед кодирующей рамкой гена снижает частоту конверсии до 0,8%. Сходная ситуация наблюдалась в случае гена HIS4, у которого горячая точка локализована в промоторном районе. А у гена HIS2 горячая точка лежит на 700 п.н. после гена.
Еще одна важная характеристика конверсии, легшая, как помнит читатель, в основу модели Холлидея, заключается в том, что конверсия может сопровождаться, а может не сопровождаться кроссинговером по внешним маркерам (рис. 1, в, г), и эти случаи равновероятны. Это правило не распространяется на соматические клетки, по крайней мере грибов, где конверсия преобладает, а на долю реципрокного кроссинговера приходится менее 10% событий. Это свидетельствует о том, что распространенная точка зрения на конверсию как на процесс нереципрокной рекомбинации, который может сопровождаться, а может не сопровождаться кроссинговером, может быть видоизменена. Либо конверсия и кроссинговер - это разные процессы, либо они возникают в результате разных способов разрешения полухиазмы, и в случае конверсии этот способ ориентирован на разрешение, не приводящее к кроссинговеру.

ЭКТОПИЧЕСКАЯ КОНВЕРСИЯ: РОЛЬ В ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ
Мы рассмотрели классическую конверсию гена, происходящую между аллелями одного гена, то есть аллельную конверсию. Однако конверсия, как и кроссинговер, может быть эктопической. Напомним, что эктопическая рекомбинация происходит между повторяющимися последовательностями (повторами) ДНК, в изобилии представленными в геноме, особенно у эукариот: гены гистонов, глобинов, рибосомных и транспортных РНК, подвижные генетические элементы и многие другие. Значение эктопической конверсии трудно переоценить, и связано это с особой ролью повторов. Эктопическая конверсия в половых клетках играет роль в эволюции генов. В настоящее время общепризнана теория, что конверсия действует как механизм, исправляющий мутации в повторах путем их постоянной "сверки". Именно конверсии приписывается роль в поддержании генетической однородности повторов, как тандемных, так и диспергированных по геному. Например, у дрожжей гены рибосомной РНК образуют около 100 тандемных повторов 9 т.п.н.-единиц (на гаплоидный геном), и у каждого штамма дрожжей их последовательности одинаковы. Кроме того, в определенных условиях конверсия, по-видимому, может действовать и в обратном направлении, распространяя мутации и обеспечивая согласованную дивергенцию повторов. Тем самым она участвует в так называемой согласованной (concerted) эволюции. Согласованная эволюция заключается в необычном поведении мультигенных семейств, чьи члены не дивергируют независимо, а проявляют сходство внутри вида (или штамма), но синхронно накапливают различия между видами.
В этом разделе мы ограничимся анализом эктопической конверсии прямых повторов ДНК (рис. 2) как более исследованной, имея в виду, что основные результаты ее изучения приложимы и к конверсии инвертированных повторов. Такая рекомбинация наиболее изучена у дрожжей. Несмотря на некоторые расхождения между результатами разных авторов, можно выделить общие закономерности. Сначала рассмотрим мейотическую рекомбинацию. Здесь бросается в глаза тот факт, что внутрихромосомная и гетерохромосомная реципрокная рекомбинация (кроссинговер) резко подавлены по сравнению с аллельной (неравный кроссинговер в меньшей степени). Зная об их роли в возникновении вредных хромосомных перестроек, это неудивительно. В отличие от реципрокных обменов частоты внутрихромосомной конверсии мало отличаются от частот аллельной: и те и другие составляют около 1-3% тетрад. Частоты гетерохромосомной конверсии (~ 0,5%) также близки к аллельной. Но в отличие от аллельной эктопическая конверсия практически никогда не сопровождается кроссинговером. Считается, что этот факт имеет большое значение для роли конверсии в поддержании стабильности повторяющихся генов: очень важно, чтобы процесс сверки повторов не сопровождался кроссинговером - источником перестроек хромосом. Важный критерий для оценки роли эктопической конверсии в эволюции - ее частоты в половых клетках. Показано, что в сперматидах мыши она столь же активный процесс, как и у дрожжей: внутрихромосомная конверсия последовательностей длиной 2,5 т.п.н. составляет ~ 2%, гетерохромосомная ~ 0,7%.

Рис. 2. Рекомбинация между прямыми повторами ДНК. Линии изображают хроматиды в профазе мейоза I. Вертикальные линии, соединяющие сестринские хроматиды, соответствуют центромерам. Негомологичная тетрада выделена зеленым цветом. Прямоугольники изображают гомологичные прямые повторы, стрелки внутри прямоугольников - их ориентацию. Х-образные соединения указывают на рекомбинацию (кроссинговер или конверсия). Рекомбинация по пути 1 аллельная, остальные относятся к эктопической. Рекомбинацию по путям 2 и 3 называют внутрихромосомной, 4 - межхромосомной (неравный кроссинговер), 5 - гетерохромосомной. Реципрокные кроссинговеры по пути 2 ведут к делециям, 3 и 4 - к сопряженным делециям и дупликациям, 5 - к транслокациям


Уровни всех типов митотической рекомбинации намного ниже по сравнению с мейотической. Подобно мейотическим клеткам, здесь также резко подавлен эктопический кроссинговер, тогда как уровни эктопической и аллельной конверсий близки. И здесь отсутствие реципрокных обменов объясняет работу эктопической конверсии в поддержании гомогенности повторов. Ведь не следует забывать, что у вегетативно размножающихся дрожжей митотические клетки обеспечивают передачу генетического материала в ряду поколений, так же как и мейотические клетки. Подавление реципрокных эктопических обменов подтверждает приведенные выше предположения, что существуют ограничения для механизма разрешения рекомбинационных интермедиатов, приводящего к кроссинговеру, или что кроссинговер и конверсия - разные процессы. Интересно, что недавно у дрожжей был выявлен ген HPR1, продукт которого специфически подавляет реципрокную рекомбинацию между повторами и не влияет на другие типы рекомбинации.

Далее...


Написать комментарий
 Copyright © 2000-2015, РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876 Rambler's Top100 Яндекс цитирования